背景及目的：　　血脑屏障(blood brain barrier，BBB)是中枢神经系统中重要的屏障之一，是维持中枢神经系统独特内环境稳定的重要结构。血脑屏障由脑内皮细胞与周细胞、星型胶质细胞及小胶质细胞等组成，能够维持脑内离子、激素和递质等的动态平衡，对一些能透过周围血管的物质具有屏障作用从而保护脑组织，对维持脑组织内环境的稳定性起着重要作用。其中，脑微血管内皮细胞间紧密连接和粘附连接是维持血脑屏障功能的核心结构，血管内皮细胞间紧密连接的完整性对维持内皮细胞极性及调节内皮细胞通透性发挥着重要的作用。血脑屏障功能的变化和紧密连接的开放与闭合有关，而紧密连接开放与否与相关蛋白表达关系密切。　　P190蛋白是一种神经元跨膜蛋白，由1384个氨基酸组成，属于单次跨膜蛋白，其N端在胞外，C端位于胞内。最初发现于有髓神经纤维郎飞氏节的节旁区轴突细胞膜上，主要在脊椎动物脑内表达，另外在卵巢、胰脏、肠、肺、心脏及睾丸等组织内也有少量表达。目前研究表明，轴突细胞膜上的P190、contactin与少突胶质细胞膜上的蛋白neurofascin155(NF155)在节旁区相互结合，形成间隔样连接，从而将郎飞氏节区的离子环境与髓鞘内轴突周围的离子环境分隔开来，保证神经冲动的跳跃式传导。P190蛋白表达异常可产生严重的神经系统功能紊乱，P190-/-型小鼠的神经冲动传导速度明显低于正常小鼠，而且在出生后不久即因神经元变性坏死而导致死亡。另外有研究显示多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)患者脑内P190表达水平明显降低。P190表达降低可进一步导致髓鞘脱离轴突，促进轴突变性坏死，进而形成神经元变性损伤的恶性循环。在糖尿病性神经病变的大鼠中，P190的表达水平也明显降低。由此可见，P190蛋白的功能是至关重要的，但其具体功能和作用机制还不清楚。　　我室研究人员发现P190蛋白除了在神经轴突有表达外，在人脑微血管内皮细胞(HBMEC)内也有大量表达，而且表达的P190蛋白在细胞间连接处有聚集的倾向。基于此，本研究以P190蛋白胞内段缺失突变细胞株作为基础，进一步检测P190胞内段缺失突变对HBMEC功能的影响;同时利用酵母双杂交的方法，筛选与P190蛋白的胞内段互作的蛋白，期望找出P190对内皮细胞功能作用的机制。　　方法：　　一、P190在脑微血管内皮细胞中的表达及其与内皮细胞单层通透性的关系　　1、激光共聚焦观察P190在小鼠不同组织血管内皮细胞中的分布。　　2、Western blot和激光共聚焦检测P190在体外分离脑血管中的表达和分布。　　3、利用HRP通透性试验，检测P190不同结构域缺失突变对HBMEC细胞单层通透性的影响。　　4、悬滴聚集试验检测P190不同结构域缺失突变及P190胞外段抗体封闭后对HBMEC的细胞间黏附力的影响。　　5、利用western blot方法检测P190胞内段缺失突变对HBMEC的紧密连接相关蛋白和粘附连接蛋白的表达的影响。　　6、利用细胞免疫荧光方法检测P190胞内段缺失突变对HBMEC的紧密连接相关蛋白和粘附连接蛋白分布的影响。　　二、P190胞内段结构域互作蛋白的筛选和鉴定　　1、利用酵母双杂交实验筛选人胎脑文库中与P190胞内段互作的蛋白，并在酵母中共转进行验证。　　2、构建PLCD3全长及不同截短和P190胞内段的重组表达质粒。　　3、共转PLCD3全长及不同截短和P190胞内段的重组表达质粒至293T细胞中，应用免疫共沉淀的方法验证P190胞内段与PLCD3相互作用，并寻找PLCD3中与P190相互作用的结构域。　　4、在HBMEC中验证P190与PLCD3相互作用。　　(1)纯化GST-P190胞内段融合蛋白，利用GST pull-down实验验证P190胞内段与PLCD3相互作用。　　(2)利用免疫共沉淀方法验证P190与PLCD3相互作用。　　5、Western blot和细胞免疫荧光检测PLCD3在HBMEC中的表达和分布　　6、构建干扰HBMEC中PLCD3表达的shRNA，获得稳定干扰PLCD3的细胞株。　　7、利用HRP通透性试验，检测PLCD3 knock down对HBMEC细胞单层通透性的影响。　　8、利用western blot方法检测PLCD3 knock down对HBMEC的紧密连接相关蛋白和粘附连接相关蛋白的表达的影响。　　三、P190与PLCD3相互作用引起HBMEC通透性改变的机制研究　　1、利用[3H]-inositol标记细胞检测培养的P190胞内段缺失细胞中PLC活化情况。　　2、构建PLCD3不同活性的重组表达质粒。　　3、免疫荧光观察P190胞内段缺失细胞和PLCD3 knock down的细胞中F-actin的变化情况。　　结果：　　一、P190在脑微血管内皮细胞中的表达及其与内皮细胞单层通透性的关系　　1、激光共聚焦结果显示P190在小鼠脑微血管内皮细胞中特异性表达。　　2、Western blot和激光共聚焦结果显示P190在体外分离的小鼠脑微血管内皮细胞中表达。　　3、成功获得P190胞内段不同结构域缺失的细胞株。　　4、HRP通透性实验表明，P190胞内段缺失内皮细胞对HRP的通透性明显高于对照组细胞，且有统计学意义;而SH3或band4.1结构域分别缺失的内皮细胞与对照组细胞相比，通透性则无明显变化。　　5、P190胞内段缺失突变破坏细胞连接相关蛋白　　(1) Western blot结果显示P190胞内段缺失不影响粘附连接相关蛋白VE-cadherin的表达，但免疫荧光结果显示P190胞内段缺失破坏了VE-cadherin在细胞连接处的分布。　　(2)悬滴聚集实验表明，P190胞内端缺失突变内皮细胞间粘附力明显降低，而用P190胞外段抗体封闭后内皮细胞间粘附力无明显改变。　　(3)Western blot结果显示，细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、claudin5和claudin3表达水平无明显改变，而occludin表达则明显下降。利用免疫荧光技术观察到ZO-1和occludin在P190胞内段缺失细胞连接处分布发生改变。　　二、P190胞内段结构域互作蛋白的筛选和鉴定　　1、酵母双杂交法筛选得到75个阳性克隆，经DNA测序和NCBI BLAST比对分析，发现了九种序列。根据文献资料选择PLCD3进行后续验证。　　2、在酵母中验证P190胞内段与PLCD3相互作用。　　3、成功构建PLCD3全长及不同截短和P190胞内段的重组表达质粒。　　4、共转PLCD3全长及不同截短和P190胞内段的重组表达质粒至293T细胞中，应用免疫共沉淀的方法验证P190胞内段与PLCD3相互作用。结果显示P190胞内段可以与PLCD3相互作用，且与PLCD3-C2结构域相互作用。　　5、在HBMEC中验证P190与PLCD3相互作用。　　(1)成功纯化GST-P190胞内段融合蛋白，利用GST pull-down实验验证P190胞内段与PLCD3相互作用。结果显示P190胞内段可以与PLCD3相互作用。　　(2)免疫共沉淀结果提示在HBMEC细胞中P190能与PLCD3相互作用　　6、Western blot检测PLCD3在HBMEC中的表达，免疫荧光结果显示PLCD3主要分布在HBMEC细胞膜和细胞核中。　　7、构建干扰HBMEC中PLCD3表达的shRNA，获得稳定干扰PLCD3的细胞株。　　8、HRP通透性试验结果显示PLCD3 knock down后HBMEC细胞单层通透性较对照组相比明显升高。　　9、Western blot结果提示PLCD3 knock down后HBMEC的紧密连接相关蛋白和粘附连接蛋白的表达无明显改变。　　三、P190与PLCD3互作引起HBMEC通透性改变的机制研究　　1、PLC活性检测结果发现P190胞内段缺失细胞株中PLC活性下降。　　2、成功构建PLCD3不同活性的重组表达质粒。　　3、免疫荧光结果显示在P190胞内段缺失和PLCD3 knock down的细胞中F-actin重组，stress fiber形成减少。　　结论：　　HBMEC细胞中P190胞内段(1305-1384aa)缺失后，可使内皮细胞单层的通透性明显提高，内皮细胞间粘附力下降，F-actin发生重组，stress fiber形成减少，紧密连接相关蛋白和粘附连接相关蛋白的表达和发布发生改变，进而破坏血脑屏障的完整性。利用酵母双杂交系统筛选出P190胞内段的相互作用的新蛋白——PLCD3。通过免疫共沉淀和GST-pull down实验证实P190胞内段可以与PLCD3相互作用，且与PLCD3-C2结构相互作用。同时干扰PLCD3在HBMEC中的表达可使内皮细胞单层通透性升高，F-actin发生重组，stress fiber形成减少，与P190胞内段缺失突变引起的现象一致。并且P190胞内段缺失突变细胞株中PLC活性下降，推测P190通过与PLCD3相互作用影响下游信号分子，使F-actin发生重组，进而破坏细胞间连接结构的完整性。