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研究背景及目的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,为多种疾病治疗的药物作用靶标,在调节细胞生长和增殖中起着重要的作用。我室前期研究工作表明,黄酮类化合物小豆蔻明(Cardamonin, CAR)通过抑制mTOR的表达与活性从而抑制VSMCs和肿瘤细胞A549增殖,过表达FKBP12及mTOR初步认定CAR抑制mTOR活性与FKBP12无关。本研究通过沉默FKBP12表达的方式旨在进一步确认小豆蔻明影响mTOR活性与FKBP12表达量的相关性,并通过检测CAR对AKT及其磷酸化蛋白表达的影响初步探讨CAR对nTORC2作用的影响,为寻找新型mTOR抑制剂提供实验基础和研究思路。方法1脂质体法转染FKBP12-siRNA最佳有效序列筛选1.1确定转染效率Lipofectamin转染FAM标记的阴性对照(NC-FAM)后置Hela细胞于C02培养箱孵育12h。在荧光显微镜下观察各孔细胞内的荧光显色,计数阳性细胞率。1.2确定转染条件将设计好的针对阳性对照GAPDHmRNA序列的siRNA,不同浓度转染Hela细胞,转染24、48h分别提取RNA,采用PCR及RT-PCR检测GAPDH mRNA的表达。1.3确定FKBP12-siRNA最佳有效序列针对FKBP12mRNA的干扰序列FKBP12-26、FKBP12-296、FKBP12-397,转染Hela细胞24h提取总RNA,72h提取总蛋白,采用PCR、RT-PCR及Western印迹法检测FKBP12mRNA及蛋白表达1.4确定转染后蛋白检测最佳时间将最佳干扰序列FKBP12-397转染Hela细胞,转染24、48、72、96h后分别提取总蛋白,Western印迹法检测目的蛋白FKBP12表达。2MTT法测定细胞增殖培养细胞加入MTT后,采用酶联免疫检测仪490nm波长测定转染后24、48、72、96h各孔细胞吸光度。3Western印迹法检测蛋白表达测定CAR对正常及转染Hela细胞mTOR. AKT、p70S6K1及其磷酸化蛋白以及FKBP12、IL-2蛋白表达的影响4确定CAR作用Hela细胞与FKBP12结合的相关性细胞增殖实验分组：Hela细胞对照组(CG),转染Hela细胞对照组(TCG),0.1%DMSO对照组(SG), CAR组(CARG1:3×10-5mol·L-1, CARG2:10"5mol·L-1, CARG3:3×10-6mol·L-1, CRAG4:10-6mol·L-1, CRAG5:10-7mol·L-1)及AZD8055组(AZDG1:10-7mol·L-1, AZDG2:10-6mol·L-1), FK506组(FKG1:3×10-6mol·L-1, FKG2:10-5mol·L-1),RAP组(RAPG:10-7mol·L-1).每组设6个复孔。蛋白表达实验分组：正常对照组(CG),转染He1a照组(TCG),0.1%DMSO对照组(SG),CAR组(CARG2:10-5mol·L-1, CARG3:3×10-6mol·L-1, CRAG4:10-6mol·L-1), FK506组(FKG2:10-5mol·L-1), RAP组(RAPG:10-7mol·L-1), AZD8055组(AZDGl：10-7mo1·L-1)。结果1转染效率从设立的3个复孔中每孔选择3个具有代表性的视野,各观察100个细胞,比较其中含有荧光的细胞数目的结果显示,转染效率为85%。2转染条件在阳性对照GAPDH-siRNA终浓度为50、100、150nmoL条件下转染24h和48h对GAPDH mRNA的表达具有不同程度的降低(P<0.05, P<0.01),其中24h、100nmoL条件下效果最好与阴性对照(NC)相比mRNA表达量可降低85.3%。3FKBP12-siRNA最佳干扰序列FKBP12-264、FKBP12-296、FKBP12-397干扰效率分别为33.08%、7.25%、74.8%。FKBP12蛋白表达灰度比值分别为0.86±0.08、0.99±0.1、0.54±0.08vs1.12±0.04；P<0.05,P>0.05, P<0.01),siRNA-397干扰效果最好。4FKBP12-siRNA干扰最佳时间FKBP12-397转染Hela细胞24、48、72、96h后抑制FKBP12蛋白表达效果随时间延长而加强,FKBP12蛋白灰度比值分别为0.8±0.07、0.71±0.04、0.444±0.06、0.61±0.04vs0.93±0.08(P>0.05, P<0.05, P<0.01, P<0.01),转染72h提取蛋白进行检测效果最好。5转染FKBP12-siRNA对Hela细胞mTOR、p70S6K及11-2蛋白表达的影响转染FKBP12-siRNA后IL-2蛋白表达有显著降低,而mTOR及p70S6K1蛋白表达无明显变化。6转染FKBP12-siRNA对Hela细胞增殖影响转染FKBP12-397的Hela细胞,生长缓慢。24,48,72,96h吸光度比值分别为：0.262±0.017vs0.261±0.004,0.46±0.019vs0.54±0.019,0.486±0.006vs0.839±0.009,0.48±0.012vs0.946±0.016(P>0.05, P<0.01,P<0.01, P<0.01)。7小豆蔻明对转染FKBP12-siRNA Hela细胞增殖影响正常Hela细胞加入CAR、AZD、FK506各组与转染FKBP12-siRNAHela细胞各加药组增殖抑制率无显著差别。RAP抑制转染FKBP12-siRNA Hela细胞增殖作用明显减弱。8小豆蔻明对转染FKBP12-siRNAHela细胞目标蛋白表达影响CAR和RAP明显抑制正常及转染FKBP12-siRNAHela组细胞P-mTOR、P-p70S6K1蛋白表达,对P-AKT及AKT、mTOR、p70S6K1总蛋白无明显影响。CAR及AZD对正常组与转染组之间的上述蛋白表达抑制效果无明显差别。而RAP抑制P-mTOR、 P-p70S6K1蛋白表达作用则明显减小。FK506与RAP均可抑制正常Hela细胞FKBP12及IL-2蛋白表达,但FK506对正常和转染组P-AKT、P-mTOR、P-p70S6K1及其总蛋白无明显影响。结论1脂质体法成功转染特异性FKBP12-siRNA序列,并显著降低Hela细胞FKBP12mRNA及蛋白的表达。2CAR可显著抑制Hela细胞增殖,且呈浓度依赖性。3CAR抑制mTOR活性的作用方式与FKBP12无关。4CAR不影响AKT及其磷酸化蛋白的表达。