目的：恶性肿瘤的发生与发展是一个多因素参与、多阶段的复杂过程，其本质体现在基因水平的变化，如癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活，导致肿瘤逃避人体自身的免疫监视系统，机体对这些发生了异常改变的细胞失去监视和清除的作用，致使肿瘤的发生和浸润转移。近年来，脾酪氨酸激酶（Spleen tyrosine kinase，Syk）在恶性肿瘤的发生和转移中的抑制作用研究日益深入，其中Syk（L）因存在功能结构域间域（IDB）核定位信号功能，具有抑癌功能，而Syk（S）则无这项功能。随着国内外的众多学者对Syk基因表达缺失与乳腺癌、胃癌、胰腺癌等各种实体肿瘤及淋巴造血系统的关系广泛而深入的研究，有学者[1]研究证实Syk在肺腺癌血清中表达较正常人中降低，且与淋巴结转移呈负相关，这就为监测肺腺癌患者淋巴结转移情况提供理论依据，但未进行详细分析、探讨；然而目前尚缺乏Syk基因对肺癌不同病理类型及其它影响预后因素关系的深入验证。由于单克隆抗体(Monoclonal Antibody，简称McAb)纯度高、特异性高、灵敏度强等特点，单克隆抗体在恶性肿瘤的早期诊断、为抗体依赖细胞介导的细胞毒性抗肿瘤治疗提供新的分子靶标、疗效及预后监测方面发挥着重要的作用。本实验拟制备高效价的抗Syk（L）单克隆抗体；应用免疫组化技术验证其在不同病理类型肺癌组织中蛋白表达的差异，以探讨Syk（L）基因在肺癌发生发展、预后、疗效评价方面的作用，为肺癌的早期临床诊断、确定病理类型、指导治疗、监测疗效、评估预后分子标志物等方面提供新的思路。方法：1抗Syk（L）单克隆抗体的制备：以高纯度的Syk蛋白作为抗原，常规免疫BALB/c小鼠，并用间接ELISA方法检测其抗血清；分离同源小鼠巨噬细胞为饲养细胞，平铺于96孔培养板；分离同系小鼠脾细胞，利用细胞融合技术将免疫动物的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，用HAT培养基培养细胞；间接细胞ELISA方法检测筛选出特定分泌抗Syk（L）抗体的阳性克隆；有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行三次克隆性培养；将多次验证均能分泌预定抗体的阳性克隆接种于同源BALB/c小鼠腹腔内，收集腹水进一步分离纯化，制备出大量的单克隆抗体；应用免疫组化技术检测Syk蛋白表达阳性及缺失的细胞（以乳腺癌细胞株MCF-7、胃腺癌细胞株MGC-803为阳性表达标准；乳腺癌MDA-MB-231细胞为阴性标准），验证本室所制备单抗的准确性、灵敏性。2应用本室制备的单克隆抗体对肺癌中Syk（L）的表达进行免疫组化验证：通过免疫组化方法检测60例初治、术前未经放化疗的不同病理类型的肺癌组织及癌周正常组织中Syk（L）蛋白表达差异，并探讨与临床特征之间的关系。结果：1制备出经ELISA方法检测，效价大于1:10000的高灵敏性、高特异性抗Syk（L）的单克隆抗体。2应用本室制备的单抗进行免疫组化验证，Syk（L）在肺癌组织及癌周正常肺组织中的表达均为阳性，且在肺癌组织中的阳性表达率（53.3%）低于正常肺组织（61.7%），结果具有统计学意义（P<0.01）见表3。前期研究中制备出的Syk多克隆抗体也得到了同样有意义的结论，但应用两种抗体检测在正常肺组织中的表达无显著差异。3应用抗Syk（L）的单克隆抗体检测，在肺癌组织中Syk（L）蛋白表达率及表达水平有差异：胞浆及胞核均阳性表达；胞浆阳性表达而胞核阴性表达；胞浆及胞核均阴性表达。4Syk（L）蛋白与肺癌病理类型的关系：应用本室制备的单克隆抗体进行检测，Syk（L）蛋白在非小细胞肺癌中（包括肺腺癌与鳞癌）阳性表达率为71.1%，高于小细胞肺癌中25%，结果有统计学意义（P<0.05）。Syk（L）在肺腺癌中阳性表达率为67.8%低于肺鳞癌中75%，两种病理类型之间有差异，但无显著统计学意义（P>0.05）。5Syk（L）蛋白与肺癌临床特征之间的关系：Syk (L)蛋白表达的下调与肺癌病理类型、临床TNM分期显著相关(P<0.05)，而与肿瘤的大小、淋巴结转移情况无关(P>0.05)。结论：1成功的制备出效价大于1:10000的高纯度、高灵敏性、高特异性抗Syk（L）的单克隆抗体，为Syk（L）蛋白的检测及下一步研究提供基础。2Syk（L）蛋白在肺癌组织细胞中表达率及表达水平低于正常肺组织细胞，表明Syk (L)与肺癌相关，是恶性肿瘤侵袭和转移的重要抑制因子。3Syk（L）蛋白在肺癌组织中表达率与表达水平有差异：胞浆及胞核均阳性表达；胞浆阳性表达而胞核阴性表达；胞浆及胞核均阴性表达。推测抑癌基因表达沉默或下调的机制，与Syk（L）基因启动子甲基化相关，应用去甲基化药物可能使基因重新表达，抑制肿瘤细胞增殖，可能为肺癌靶向治疗提供新的思路。4Syk（L）蛋白在肺癌不同病理类型中表达量不同，鳞癌、腺癌、小细胞肺癌中依次下降；在小细胞肺癌中的表达显著低于非小细胞肺癌（包括肺腺癌及鳞癌）中的表达，这与小细胞肺癌恶性程度更高、预后更差的临床特点相符合。Syk（L）蛋白在肺鳞癌和腺癌中表达有差异，但无显著统计学意义，这需要扩大病例数、联合其它分子标志物进一步验证。5Syk（L）蛋白表达与临床TNM分期显著负相关，与肿瘤大小、淋巴结转移情况无关，但仍需进一步进行淋巴结及病灶情况的亚组分析。综上所述，本实验成功地制备出抗Syk（L）单克隆抗体，并对不同病理类型肺癌组织进行验证，为研究Syk（L）作为抑癌基因，在肺癌的早期诊断、病理类型的判定、病情分期、预后及疗效评价的新的肿瘤标志物方面提供了理论依据；并可能为肺癌的靶向性治疗提供新的思路。