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目的1.对LPS刺激后的DC2.4成熟性进行鉴定,确保后续实验的科学性与可行性。2.青藤碱作用于成熟DC2.4后,观察细胞内SOCS1、JAK2、STAT1蛋白与基因含量变化及上清液中IFN-γ、IL-6、IL-10含量变化,探讨青藤碱对DC2.4细胞内JAK/STAT信号通路的磷酸化作用机制,及其治疗类风湿关节炎机制,为治疗类风湿关节炎寻找新的治疗靶点。方法1.通过形态学及细胞膜上表型CD11C、CD80及CD86判定DC2.4成熟状态。2.将DC2.4细胞进行培养并分为A、B、C三组,A组为空白组,B组为模型组,C组为青藤碱组。A组不做处理,B组、C组分别经5μg/m L的LPS刺激培养24h,使DC2.4成熟,C组中继续加入40μg/mL的青藤碱,A组、B组不做进一步处理,继续培养三组细胞48h。Rt-PCR法检测三组细胞中SOCS1、JAK2、STAT1基因表达;Western Blot法检测各组细胞中SOCS1、JAK2、STAT1、p-JAK2、p-STAT1蛋白表达;取上清液,ELISA法检测炎症因子IFN-γ、IL-6、IL-10含量。结果1.DC2.4成熟性鉴定(1)细胞形态学:DC2.4呈贴壁状态,为多角形、星形或梭形。加入LPS后,细胞状态改变不明显,仍为多角形、星形,且突起数目和长度较多。(2)表面标志物:通过流式细胞仪检测细胞表面标志物,发现DC2.4经LPS作用24h后CD86的阳性百分率较未经LPS作用的空白组明显增加(P<0.01);经LPS作用24h后的DC2.4表面CD80平均荧光强度值较空白组明显增加(P<0.01);DC2.4经LPS作用24h与未经LPS作用相比,其两组细胞表面的分子CD11c的平均荧光强度值无差异(P>0.05),无统计学意义。2.青藤碱对DC2.4 JAK/STAT信号通路磷酸化作用(1)Rt-PCR检测三组DC2.4细胞中SOCS1、JAK2、STAT1 mRNA的表达与A组相比,B组DC2.4细胞内JAK2、STAT1明显增高(P<0.05),SOCS1表达降低(P<0.05);与B组比较,C组SOCS1表达增加(P<0.05),而JAK2、STAT1表达量降低(P<0.05)。(2)Western Blot检测三组细胞中SOCS1、JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1蛋白的表达。与A组相比,B组DC2.4细胞内p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1的表达量明显增高,SOCS1的表达量降低;与B组相比,C组DC2.4细胞中p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1表达降低,SOCS1的表达量显著增加。(3)ELISA法检测上清液中炎性因子IFN-γ、IL-6、IL-10的表达与A组相比,B组DC2.4细胞内IFN-γ、IL-6含量明显降低(P<0.01),而IL-10含量增加(P<0.01);与B组比较,C组的IL-10含量明显增加(P<0.01),IFN-γ含量相对减少(P<0.01),具有统计学差异。结论1.DC2.4细胞为未成熟DC,经LPS作用后可转变为成熟DC。2.JAK/STAT通路中JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、SOCS含量变化受DC2.4细胞状态影响。3.青藤碱作用成熟DC2.4后,可以抑制JAK2/STAT1通路传导,其机制可能是青藤碱作用DC2.4后,活化细胞内的SOCS1,进而抑制JAK2和STAT1活化为蛋白p-JAK2、p-STAT1,从而抑制JAK2/STAT1通路磷酸化,阻碍信号转导。4.青藤碱作用成熟DC2.4后,可以抑制促炎因子INF-γ、IL-6分泌,促进抗炎因子IL-10分泌。5.青藤碱治疗RA作用机理可能是青藤碱作用成熟DC,激活其细胞内的SOCS1,从而抑制细胞内JAK2的磷酸化,进而阻断其底物STAT1的磷酸化,使p-JAK2与p-STAT1含量减低,抑制JAK2/STAT1信号通路,减少促炎因子INF-γ、IL-6释放,增加抗炎因子IL-10释放,同时抑制DC成熟,最终抑制炎症,达到治疗RA目的。