一、研究背景与目的炎症性肠病(IBD)是一种病变部位主要位于结肠及直肠的慢性肠道非特异性炎症,具有慢性迁延、反复发作及难以治愈的特点,主要包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD),临床表现以腹痛、腹泻、粘液脓血便和体重减轻为主。炎症性肠病过去在西方国家发病率较高,近年来,随着生活方式和饮食习惯的西化,我国发病率也呈逐年上升和年轻化趋势。其与遗传、环境、微生物和免疫等多个因素相关,但确切的病因和发病机制尚不清楚。研究表明,肠道慢性炎症是结直肠癌三大主要危险因素之一,并与肠道炎症病程、严重程度呈正相关,病程超过30年的IBD患者,高达18%可发展为结直肠癌。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR (mammalian target of rapamycin)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。其在体内能形成两种不同的复合物,分别是mTORC1 (mTOR complex 1)和mTORC2 (mTOR complex 2)。mTORC1由mTOR、Raptor、mLST8和PRAS40组成,具有整合营养、生长因子、能量和应激等一系列信号通路,进而调控细胞代谢、细胞生长、增殖和存活。在这些上游信号因子的作用下,mTORC1被两种小的GTP酶所激活,分别是Rheb和Rags。结合上GTP的Rheb(此时该蛋白处于活化状态),反过来被结节性硬化复合物(tuberous sclerosis complex 1/2, TSC1/2)所抑制。TSC1/2具有GTP酶活化蛋白(GAP)活性,能使Rheb上的GTP分解成为GDP,从而使Rheb失活。TSC1/2的缺失会导致组织细胞中mTORC1活性的持续激活,最终促进炎症和肿瘤的发生。雷帕霉素(Rapamycin)可特异性地抑制mTORCl信号。mTORC2包括mTOR、 mLST8、Rictor、PRR5和mSin1,有文献表明在酵母和哺乳动物细胞,mTORC2可调控肌动蛋白聚合和细胞骨架重排。mTORC2可磷酸化AKT的疏水基序(HM)(Ser473位点),继而使其成为具有完全活性的激酶,AKT是调节细胞存活的关键激酶之一,因而mTORC2可能在细胞存活、细胞骨架调节与运动中起调节作用,但其功能和活化机制目前尚不清楚。越来越多证据表明,mTOR信号通路在炎症反应发生发展过程中起重要作用,是促炎关键因素。炎症因子如TNF-α、VEGF、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-12p40及IFN-y等分泌均受mTOR信号调节。IL-6是一种重要的促炎因子,其作用主要通过可溶性IL-6受体、而非IL-6膜受体介导,而mTOR活性增高可增加细胞内可溶性IL-6受体表达。另外,在炎症相关的胃癌小鼠(gp130)模型中,IL-6通过GP130/JAK通路激活STAT3的同时,也激活PI3K/mTORCl,而mTORC1抑制剂RAD001可显著抑制炎症,从而抑制炎症相关的胃癌发生。流行病学显示,高脂饮食是炎症性肠病发生的一个重要因素,而高脂饮食可使mTOR通路持续激活。有学者发现,高脂饮食大鼠肝细胞mTOR的磷酸化水平(p-mTOR)与IL-la、IL-6和TNF-a的表达水平均升高,且p-mTOR与TNF-a的表达水平呈正相关。在小鼠炎症性肠病和结直肠癌的模型中,炎症病灶与肿瘤病灶的mTOR-STAT活性均增强,且炎症病灶小肠上皮细胞的增殖依赖于mTORC1的活性。临床数据资料显示,约57%炎症性肠病人标本中观察到mTORC1信号通路的活化。可见,mTOR信号通路与炎症性肠病发生发展关系密切。然而,炎症性肠病与mTORCl的相互关系尚未见报道。二、研究方法1、应用Cre-loxp系统,我们成功构建了结肠上皮细胞特异性Tsc1敲除小鼠。应用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型的鉴定,用western blot和免疫荧光确定Tscl敲除效果。2、通过对Tscl敲除小鼠发育观察和结肠组织的分析,探索mTORC1过度激活对2月龄大的小鼠生长发育、结肠结构与功能的影响。3、应用葡聚糖硫酸钠(DSS)模拟C57小鼠炎症性肠病模型,通过大便性状,大便隐血试验,体重变化趋势和结肠组织HE切片评估小鼠炎症性肠病严重程度。4、通过给予C57肠炎小鼠mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素处理,探讨雷帕霉素可否逆转DSS造成的小鼠肠炎。5、通过结肠上皮细胞特异性Tscl, Raptor敲除小鼠DSS诱导肠炎,探索mTORC1激活/抑制对小鼠炎症性肠病的影响。6、通过对特异性Tscl敲除小鼠结肠上皮细胞mRNA芯片高通量筛查,初步探讨mTORC1信号通路对IBD发生发展的影响。三、研究结果1、构建结肠上皮细胞特异性Tscl敲除小鼠,并证明其对2月龄大小鼠生长发育、结肠结构与功能无明显影响我们应用Cre-loxp系统(Carl-cre, Tsc1loxp/loxp)实现了在结肠上皮细胞特异性地Tsc1敲除,构建了结肠上皮细胞特异性Tscl敲除小鼠(Tsc1KO)。为了验证基因敲除效果,我们应用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行基因型的鉴定,并完整游离小鼠结肠全长,分离结肠上皮细胞,取结肠组织固定包埋,通过western blot检测结肠上皮细胞Tsc1蛋白表达水平和免疫荧光检测小鼠结肠上皮细胞mTORC1的下游靶蛋白S6的磷酸化水平。我们发现结肠上皮细胞Tscl特异性敲除小鼠Tscl蛋白表达水平下降而p-S6 (S235/S236)的水平显著升高。可见,通过Cre-loxp系统,我们成功实现了结肠上皮细胞特异性敲除Tscl基因,并检测到mTORC1活性的过度激活。接着我们对比了2月龄大结肠上皮细胞特异性Tscl敲除小鼠的外形、毛色和体重,测量结肠全长长度,通过显微镜结合HE切片观察小鼠结肠结构,以及通过PAS染色评估杯状细胞分泌功能,均未见野生型小鼠和敲除小鼠有明显差异。可见,小鼠结肠上皮细胞特异性Tscl敲除,对2月龄大小鼠生长发育、结肠结构与功能均无明显影响。2、DSS诱导的C57小鼠炎症性肠病模型可被mTORCl的特异性抑制剂——雷帕霉素部分逆转我们运用DSS构建C57小鼠炎症性肠病模型。通过对小鼠大便性状,大便隐血试验,体重变化趋势和结肠组织HE切片评估小鼠炎症性肠病严重程度。我们发现,自由饮用DSS后,C57小鼠均出现不同程度的腹泻,大便隐血或血便,体重逐步减轻。肉眼可见结肠充血、水肿、变短,HE切片光镜下观察可见结肠结构明显破坏,出现以结肠末端为主小溃疡,黏膜及黏膜下层大量炎症细胞浸润。而同时给予雷帕霉素灌胃的小鼠,无论是大便性状,大便隐血试验,体重变化的临床指标,或是HE切片病理评估,都得到不同程度的缓解。证明了mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素可部分逆转DSS造成的C57小鼠炎症性肠病。3、小鼠结肠上皮细胞mTORC1过度激活加剧了DSS诱导的炎症性肠病在此基础上,我们进一步探讨了小鼠结肠上皮细胞特异性敲除Tscl, Ratpor致mTORC1过度激活／抑制对DSS诱导的炎症性肠病的影响。我们观察可得,给予DSS自由饮用的结肠上皮细胞特异性Tscl敲除小鼠,腹泻、大便隐血或血便、体重减轻程度、小鼠结肠结构破坏均比野生型小鼠严重。接着,我们在Raptor敲除小鼠上重复了DSS模型,上述各项指标均在Raptor敲除鼠中得到不同程度的改善。因此,我们认为小鼠结肠上皮细胞mTORCl过度激活加剧了DSS诱导的炎症性肠病。4、特异性Tscl敲除小鼠结肠上皮细胞mRNA芯片高通量筛查,探讨mTORCl信号通路对IBD发生发展的影响。应用mRNA芯片高通量筛查,我们发现小鼠结肠上皮细胞特异性敲除Tscl基因,其炎症、趋化相关的mRNA表达明显高于野生型小鼠。筛查结果显示：与目前IBD研究密切相关的IL-6、IL-17、IL-23、TNFa和COX的炎症因子表达,在Tscl敲除鼠中,均有3倍以上的增高。因而,我们推测：小鼠结肠上皮细胞Tscl基因敲除,mTORC1信号通路过度激活,通过经典的转录因子NF-κB和STAT3调控炎症因子的表达,在外源性刺激作用下,通过增加促炎因子的表达,降低抗炎因子的表达,促进IBD的发生发展。四、结论1、结肠上皮细胞特异性Tsc1敲除对2月龄大小鼠生长发育、结肠结构与功能无明显影响。2、mTORC1特异性抑制剂——雷帕霉素可部分逆转C57小鼠DSS诱导的炎症性肠病。3、小鼠结肠上皮细胞mTORC1过度激活加重了小鼠炎症性肠病程度。4、特异性Tscl敲除小鼠结肠上皮mRNA芯片高通量筛查初步阐明了mTORC1信号通路参与IBD发生发展。5、mTORC1信号通路为IBD的发生发展提供新的解释机制,mTORC1抑制剂可能为炎症性肠病的治疗提供新思路。