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四环素(tetracycline, Tet)调控诱导表达系统是近年来发展起来的具有高效、严密开关功能的基因表达调控系统,诱导物是四环素或四环素衍生物,通过诱导物可以从时空角度上特异性地控制外源基因在转基因细胞和转基因动物中的表达。本实验应用Tet-on系统,构建四环素调控淋巴样生长因子基因(LEF-1)表达的表达载体,并与Tet-on系统中的诱导表达载体pcDNA6共转染绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞。通过四环素诱导来检测LEF1基因在mRNA水平的表达量。下图是对四环素诱导系统的简单介绍：四环素诱导调控表达系统主要包括调控表达载体pcDNA4和反应表达载体pcDNA6两种质粒。调控表达载体pcDNA4主要由启动子,操纵序列和目的基因组成；反应表达载体pcDNA6通过启动子表达阻遏蛋白TetR。将pcDNA4和pcDNA6两质粒通过共转染的方法转染体外培养的细胞后,pcDNA6载体表达的阻遏蛋白TetR与表达载体pcDNA4上的操纵序列结合,阻遏了目的基因的表达。当细胞培养液中四环素Tet或四环素衍生物强力霉素(DOX)存在时,可与pcDNA4的操纵序列结合,从而引起阻遏蛋白TetR构想发生变化,从操纵序列上脱落下来,最终诱导目的基因的转录。1LEF1基因毛囊特异性表达载体pcDNA4-KL的构建本研究应用四环素调控诱导表达系统,以系统中的调控表达载体pcDNA4为基本骨架,选用角蛋白关联蛋白KAP6.1基因启动子为构建最终表达载体的启动子,启动目的基因淋巴样生长因子LEF1基因。KAP6.1基因启动子片段及LEF1基因片段的获得是通过PCR扩增法,分别以现有的表达载体pcDsRed2-KV和载体pCDsRed2-KL为模板,使用LA TAq DNA聚合酶合成相应片段。将四环素调控表达系统中的表达载体pcDNA4/TO通过相应限制性内切酶酶切,以及T4连接酶将目的片段连接后,得到的新的载体为修改后的载体,与原pcDNA4/TO载体相比,删除了部分序列。然后用PCR扩增出的角蛋白关联蛋白KAP6.1基因启动子片段替换载体中的原始启动子CMV片段,淋巴样生长因子I(LEF1)片段插入修改后的表达载体pcDNA的多克隆位点(MCS)。实验在构建载体pcDNA4-KL的过程中,角蛋白关联蛋白KAP6.1基因启动子与pMD19T连接,重组质粒经过限制性内切酶酶切电泳,发现片段大小及连接都正确。从而可以进一步检测片段序列,更好行驶基因功能,发挥在载体上的作用。挑选重组质粒并编号委托上海生工生物有限公司测序,应用生物专用软件genebank,查找LEF1基因序列,与测序结果相比对,结果证明正确。淋巴样生长因子I(LEF1)片段的检测与KAP6.1启动子片段一样,结果证明也正确。将测序正确的pMD19-TK与修改后的pcDNA4两质粒用NdeI和MluI两限制性内切酶双酶切后,用T4连接酶连接相应的目的片段,经过酶切鉴定KAP6.1基因启动子片段正确连入载体pcDNA4启动子区域,得到载体pcDNA4-K。BamHI和EcoRI两限制性内切酶双酶切pMD19T-L和pcDNA4-K, T4连接酶连接相应的目的片段,经酶切鉴定LEF1基因片段正确插入载体pcDNA4-K的MCS位点上。为下一步与四环素调控表达系统中的表达载体pcDNA6共同转染细胞奠定了基础。2胎儿皮肤成纤维细胞培养及共转染在体外分离培养胎儿皮肤成纤维细胞,并且进行双载体共转染细胞实验。配置含有10%FBS的DMEM/F12的细胞培养液,培养原代胎儿皮肤成纤维细胞,于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养；当细胞生长铺满整个培养皿后,冷冻保存细胞。配置细胞冷冻保存液,即10%DMSO+90%FBS。利用脂质体Lipoftaecmine TM介导法,将表达载体pcDNA4-KL和诱导表达载体pcDNA6共转染绒山羊第二代胎儿成纤维细胞,用合适的抗生素Blasticidin和博莱霉素Zeocin两种抗生素浓度共同筛选细胞,筛选12后得到单克隆细胞。0.25%胰酶消化单克隆细胞扩大培养,待细胞长满整个皿后,提取其基因组DNA,进行PCR鉴定。Blasticidin浓度为13μg/ml及Zeocin浓度为1500μg/ml的两种抗生素共同筛选12天,获得单克隆细胞。利用克隆杯胰酶消化法,将单克隆细胞扩大培养,用普通基因DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA,经PCR扩增电泳鉴定表达载体pcDNA4-KL已与细胞基因组稳定整合,同时表达载体pcDNA6与细胞基因组也稳定整合。可以进行下一步的四环素诱导及检测。3四环素诱导目的基因LEF1在皮肤成纤维细胞中的表达设置诱导物四环素(Tet)在不同浓度(0ug/ml,1ug/ml,10ug/ml,20ug/ml)下,对转有毛囊特异性表达载体pcDNA-KL和诱导表达载体pcDNA6的转基因细胞,于10%FBS+DMEM/F12培养液、37℃、5%CO：、饱和湿度条件下进行培养诱导。24h后,提取不同四环素诱导下的细胞RNA,经过反转录成cDNA,通过实时方法来检测淋巴样增强因子(LEF1)在mRNA水平上的表达,确定四环素的最佳浓度。