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群结腐霉菌（Pythium myriotylum）是引起生姜（Zingiber officinal）茎基腐病和烟草（Nicotiana tabacum）根腐病的主要病原菌之一,给生姜和烟草产业带来了巨大的经济损失。病原菌分泌的坏死和乙烯诱导类似蛋白（Necrosis and ethylene-inducing peptide 1（Nep1）-like protein,NLPs）通常定位于植物质外体空间,通过结合细胞膜上的鞘脂发挥毒性作用,而有些被细胞膜上的受体蛋白识别诱导植物免疫反应。前期研究发现群结腐霉菌侵染生姜过程中大部分NLPs编码基因上调表达,推测NLPs在群结腐霉菌侵染危害过程中扮演重要角色。本文对群结腐霉菌NLPs的特征及其在侵染生姜和烟草中的功能进行研究,获得以下研究结果:1.群结腐霉菌诱导本氏烟细胞死亡的NLP效应子的鉴定:实验室前期对群结腐霉菌SWQ7菌株进行全基因组分析,鉴定到19个NLPs。本实验利用农杆菌介导的本氏烟瞬时表达体系,对其中6个NLPs（Pm＿NLP-1、Pm＿NLP-3、Pm＿NLP-4、Pm＿NLP-6、Pm＿NLP-12和Pm＿NLP-14）进行诱导细胞死亡功能分析。结果发现,6个NLPs在本氏烟叶片上均能诱导细胞死亡,其中4个NLPs（Pm＿NLP-1、Pm＿NLP-3、Pm＿NLP-4和Pm＿NLP-6）与致病疫霉（Phytophthora infestans）INF1诱导细胞死亡速度相似,另外2个（Pm＿NLP-12和Pm＿NLP-14）与INF1相比较慢。表明上述6个NLPs均可诱导本氏烟细胞死亡,且诱导细胞死亡速度有差异。2.群结腐霉菌NLP效应子的功能分析:利用生物信息学软件对19个NLPs进行亚细胞定位预测,结果显示其中4个NLPs（Pm＿NLP-1、Pm＿NLP-2、Pm＿NLP-18和Pm＿NLP-19,其中Pm＿NLP-1与Pm＿NLP-2蛋白质序列相同）定位在细胞内,与以往报道不同。为验证其发挥作用的亚细胞场所,本实验利用荧光显微镜观察发现,4个NLPs（Pm＿NLP-1、Pm＿NLP-4、Pm＿NLP-18和Pm＿NLP-19）去除信号肽后主要定位在本氏烟细胞质和细胞核,然而,均丧失细胞死亡诱导功能。表明信号肽对上述4个NLPs细胞死亡诱导功能至关重要,其去除信号肽后定位于细胞内可能发挥其他功能。研究表明具有细胞死亡诱导功能的NLPs均含有保守的七肽基序（GHRHDWE）,分析发现群结腐霉菌19个NLPs中有两种形式的七肽基序:“GHRHEWE”和“GHRHDWE”。本实验选择代表性的4个NLPs（Pm＿NLP-1和Pm＿NLP-4含有“GHRHEWE”,Pm＿NLP-12和Pm＿NLP-14含有“GHRHDWE”）,分析七肽基序对其诱导细胞死亡的作用。利用单位点突变和农杆菌介导的本氏烟瞬时表达体系,将这4个NLPs七肽基序中的第五位谷氨酸“E”或天冬氨酸“D”突变为赖氨酸“K”。结果发现,突变后的4种NLPs在本氏烟中丧失细胞死亡诱导功能。表明上述4个NLPs的保守七肽基序中第五位氨基酸对其诱导细胞死亡功能至关重要。3.群结腐霉菌重组NLPs对本氏烟和生姜细胞毒性作用分析:研究表明NLPs通常能诱导双子叶植物细胞死亡,主要由于双子叶植物细胞膜上含有大量NLPs受体,即A类糖基肌醇磷酸神经酰胺（Glycosyl Inositol Phosphorylceramide,GIPC）鞘脂。为研究重组NLPs对本氏烟和生姜细胞的毒性作用区别,分析本氏烟叶片和生姜不同组织（叶、鞘茎和根）中GIPC鞘脂的种类差异,结果发现本氏烟叶片95%以上的GIPC为A类,生姜各组织中A类GIPC占80%左右。选择能诱导本氏烟细胞死亡的6个NLPs中的3个NLPs（Pm＿NLP-1、Pm＿NLP-4和Pm＿NLP-12）进行异源表达,对获得的重组蛋白进行细胞死亡诱导功能分析,结果发现,3个重组NLPs均能诱导本氏烟叶片细胞死亡,但不诱导生姜叶片细胞死亡。4.群结腐霉菌对烟草的致病性及其一种NLP蛋白对烟草的毒性作用分析:对分离自我国3个主要烟草种植区（重庆、河南、四川）生姜上的6株群结腐霉菌（Ch Y1、Ch Y3、HNP1、HNP10、Si L1和Si L2）进行烟草致病力及致病因素分析。多位点序列分析（Multilocus Sequence Analysis,MLSA）显示6菌株处于4个不同的分组,具有一定的遗传差异。幼苗接种实验结果显示,6株群结腐霉菌均能侵染三生烟及其他3种商品化烟草品种（红花大金元、云烟87和K326）,同种菌株对不同品种烟草的致病性差异不显著（P＞0.05）。盆栽和离体叶片接种实验与幼苗接种实验结果一致,6株群结腐霉菌均能侵染三生烟,而且致病力存在差异,其中分离自四川的Si L1和Si L2致病性相对较强。异源表达的群结腐霉菌Pm＿NLP-12蛋白能诱导三生烟叶片细胞死亡,表明群结腐霉菌产生的NLP蛋白可能是侵染烟草的致病因素之一。