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目的:真菌广泛存在于空气、土壤等人类赖以生存的环境中,吸入真菌污染的有机粉尘可能会导致过敏性肺炎。重复暴露真菌污染的有机粉尘可导致慢性炎症、肉芽肿甚至是不可逆的肺纤维化,为社会经济和医疗带来巨大的负担。然而,过敏性肺炎具体发病机制尚不明确。1,3-β-葡聚糖作为真菌细胞壁的重要成分,是公认的真菌暴露标志物,常用于真菌所致的过敏性肺炎的深入机制研究。上皮细胞是肺部第一道天然防线的重要组成细胞,其损伤和死亡都可导致免疫屏障破坏。自噬是维持细胞生存和内稳态的重要生理过程。调控细胞自噬可影响组织炎症反应。HMGB1作为一种经典的多功能因子,可在多个层次上影响细胞自噬,维持细胞内稳态。然而,HMGB1对1,3-β-葡聚糖所致的肺部炎症的调控作用及其具体调控机制尚未明确。因此,本研究利用1,3-β-葡聚糖建立小鼠肺部炎症模型,用6型腺相关病毒建立小鼠体内HMGB1沉默模型,深入研究HMGB1对1,3-β-葡聚糖所致肺部炎症进程以及肉芽肿产生的调控机制。研究方法:本研究采用雄性C57BL/6小鼠,按体重随机分为六组:（1）对照组:saline;（2）实验组:1,3-β-glucan;（3）对照空病毒组:saline+AAV-NC;（4）实验空病毒组:1,3-β-glucan+AAV-NC;（5）对照沉默组:saline+AAV-sh-HMGB1;（6）实验沉默组:1,3-β-glucan+AAV-sh-HMGB1。经非暴露气管灌注1,3-β-葡聚糖悬液建立肺部炎症模型,应用搭载了sh-HMGB1的6型腺相关病毒建立小鼠肺部HMGB1沉默模型。通过ELISA、Western Blot以及Realtime-PCR法确认HMGB1的沉默效果;用免疫荧光观察HMGB1蛋白表达水平;利用H&E染色检测各组小鼠炎症反应;用Luminex和Realtime-PCR法检测肺泡灌洗液（BALF）中各细胞因子的分泌水平及肺组织内相应因子的转录水平;通过对小鼠肺组织羟脯氨酸含量的测定和Masson染色检测沉默HMGB1对胶原沉积的影响。以上实验均用以说明沉默HMGB1对1,3-β-葡聚糖引起的肺部炎症的调控作用。利用1,3-β-葡聚糖处理人肺上皮细胞系A549,建立上皮细胞体外炎症模型,并通过转染搭载sh-HMGB1的慢病毒构建体外HMGB1沉默模型。通过Realtime-PCR和ELISA法检测各组上皮细胞细胞因子的表达和分泌水平;采用免疫荧光法检测HMGB1在上皮细胞的表达水平;应用Realtime-PCR和Western Blot法检测1,3-β-葡聚糖暴露以及沉默HMGB1对小鼠肺组织自噬相关蛋白表达水平的影响;利用透射电镜观察小鼠肺组织中上皮细胞的自噬小体产生;利用免疫荧光方法检测沉默HMGB1对A549细胞自噬水平的影响。上述实验用来说明沉默HMGB1对1,3-β-葡聚糖所致上皮细胞自噬的调控作用。免疫荧光、Western Blot和Realtime-PCR法测定沉默HMGB1对自噬流的调控作用;通过免疫共沉淀法探究沉默HMGB1对1,3-β-葡聚糖所致肺部炎症模型中Beclin1和BCL2结合的影响,及沉默HMGB1对Beclin1蛋白翻译后修饰的影响;利用Western Blot和Realtime-PCR法检测各组小鼠肺组织内凋亡相关蛋白的表达水平,并采用TUNEL染色方法进一步证明HMGB1对凋亡水平的影响;通过CCK8法检测给予自噬激活剂和凋亡抑制剂后A549的细胞活力改变。上述实验用以探究沉默HMGB1对1,3-β-葡聚糖所致自噬的具体调控位点。结果:1、沉默HMGB1可加重1,3-β-葡聚糖所致的肺部炎症。H&E染色结果显示,1,3-β-葡聚糖暴露早期（3天）和晚期（28天）的小鼠肺组织炎性细胞浸润明显,上皮细胞出现增厚、变形、脱落。沉默HMGB1后可进一步加重由1,3-β-葡聚糖所致的炎性损伤;用Luminex法检测肺泡灌洗液中的相关炎性因子和趋化因子的分泌水平。结果显示沉默HMGB1可增加由1,3-β-葡聚糖处理引起的CCL5的分泌水平（P<0.01）,TNF-α和ICAM-1的表达水平未见明显改变;Realtime-PCR检测结果显示肺组织中相应因子的表达与Luminex结果一致（P<0.05）。2、沉默HMGB1可加重1,3-β-葡聚糖所引起的肺组织胶原沉积。Masson染色法显示1,3-β-葡聚糖暴露早期（3天）和晚期（28天）的小鼠肺组织未见明显胶原沉积。与实验组小鼠相比,沉默HMGB1后1,3-β-葡聚糖暴露晚期（28天）的小鼠肺组织切片胶原沉积明显;检测肺组织羟脯氨酸含量,结果显示,沉默HMGB1可明显加重暴露晚期的小鼠肺组织胶原含量（P<0.05）。3、沉默HMGB1可加重1,3-β-葡聚糖所致的肺上皮细胞损伤。使用免疫荧光法检测肺组织HMGB1和上皮细胞标志物EPCAM的表达情况。结果表明HMGB1在肺上皮细胞上高度表达;通过ELISA和Realtime-PCR法检测A549细胞及其上清液中细胞因子的表达水平。结果显示1,3-β-葡聚糖处理可促进CCL5,TNF-α和ICAM-1分泌和表达增多。沉默HMGB1可进一步促进由1,3-β-葡聚糖所致的CCL5表达水平增加（P<0.01）,TNF-α和ICAM-1的表达未见明显改变。4、沉默HMGB1可抑制1,3-β-葡聚糖导致的肺上皮细胞自噬反应。透射电镜结果显示,1,3-β-葡聚糖暴露早期（3天）和晚期（28天）的小鼠肺泡上皮细胞出现大量自噬小体。沉默HMGB1后自噬小体产生的数量明显降低;通过Western Blot和Realtime-PCR法检测各时间点小鼠肺组织中LC3和P62的表达水平。结果显示1,3-β-葡聚糖可增加肺组织中LC3和P62的表达（P<0.05）。沉默HMGB1显著降低LC3和P62的表达水平（P<0.05）;采用免疫荧光法检测细胞中LC3的表达水平。结果显示1,3-β-葡聚糖可促进A549细胞的自噬水平（P<0.05）,沉默HMGB1可降低A549细胞的自噬水平（P<0.05）。5、沉默HMGB1可通过调控Beclin1抑制肺上皮细胞自噬流。采用免疫荧光法检测各组小鼠肺组织切片中LC3和LAMP1的表达水平。结果显示在1,3-β-葡聚糖暴露早期（3天）和晚期（28天）,小鼠肺组织细胞中自噬小体和溶酶体结合阶段断裂,沉默HMGB1未能影响1,3-β-葡聚糖所致的自噬流断裂;Western Blot和Realtime-PCR检测结果表明,1,3-β-葡聚糖暴露早期（3天）和晚期（28天）小鼠肺组织LAMP1蛋白和基因水平明显降低（P<0.05）。沉默HMGB1后LAMP1的表达水平相比于实验组未见显著改变;利用Western Blot和Realtime-PCR法检测各时间点小鼠肺组织m TOR,p-m TOR和Beclin1的蛋白表达水平以及Becn1的基因表达水平。结果显示与对照组相比,实验组的小鼠p-m TOR/m TOR显著降低,Beclin1的表达显著升高（P<0.05）。与实验组小鼠相比,实验沉默组小鼠p-m TOR/m TOR表达水平未见明显差异,Beclin1表达水平有所增加。6、沉默HMGB1可促进1,3-β-葡聚糖所致肺上皮细胞自噬中Beclin1和BCL2的结合。通过免疫荧光法检测1,3-β-葡聚糖暴露早期（3天）小鼠肺组织中Beclin1和BCL2的表达情况。结果显示沉默HMGB1促进Beclin1和BCL2的蛋白共定位;采用免疫共沉淀法检测小鼠肺组织中Beclin1和BCL2的结合水平。结果显示在1,3-β-葡聚糖所致的自噬反应中,沉默HMGB1可明显增加Beclin1和BCL2的结合水平。7、沉默HMGB1可抑制1,3-β-葡聚糖所致肺上皮细胞自噬中Beclin1的蛋白翻译后修饰。利用免疫共沉淀的方法提取1,3-β-葡聚糖暴露早期（3天）小鼠肺组织中的Beclin1蛋白,检测其泛素化水平的改变。结果显示沉默HMGB1可明显降低Beclin1的泛素化修饰水平。8、沉默HMGB1可加剧1,3-β-葡聚糖所致肺组织凋亡水平。采用TUNEL染色法检测1,3-β-葡聚糖暴露早期（3天）和晚期（28天）的小鼠肺组织凋亡水平。结果表明,与对照组相比,实验组小鼠肺组织细胞凋亡明显增加。沉默HMGB1可进一步加重小鼠肺组织的凋亡水平;利用Western Blot和Realtime-PCR法检测1,3-β-葡聚糖暴露早期（3天）和晚期（28天）的小鼠肺组织凋亡相关蛋白BCL2和BAX的表达水平。结果显示1,3-β-葡聚糖可增加BAX的蛋白和基因表达水平,降低BCL2的蛋白和基因水平（P<0.05）。沉默HMGB1可进一步增加BAX的蛋白和基因水平,降低Bcl2的基因表达水平（P<0.05）。9、沉默HMGB1可调控1,3-β-葡聚糖诱导的肺上皮细胞自噬和凋亡水平。利用CCK8法检测A549细胞的细胞活力。结果显示,与单纯1,3-β-葡聚糖处理的细胞相比,沉默HMGB1可显著降低A549细胞的细胞活力（P<0.05）。自噬激活剂Rapamycin和凋亡抑制剂Z-VAD-FMK处理均可明显恢复沉默HMGB1损伤的细胞活力（P<0.05）。结论:HMGB1可通过调控Beclin1泛素化水平,影响Beclin1和BCL2结合,进而增强1,3-β-葡聚糖诱导的肺上皮细胞自噬的成核阶段,从而促进肺上皮细胞自噬反应,参与抑制1,3-β-葡聚糖所致的肺部炎症。