背景和目的胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,胃腺癌是胃癌最主要的病理类型,具有易侵袭和转移的特点,早期诊断率极低。尽管近年来全世界胃癌的发病率和死亡率逐渐下降,但在东亚国家,特别是中国、日本,胃癌的发病率仍然较高。在中国,胃癌为第二大常见癌症,每年有约30万人死亡和40万新发病例。尽管近年在胃癌的诊断和治疗方面取得了重大进展,外科手术仍然是根治胃癌的主要手段,而且有相当大比例的患者手术后会发生复发和转移,实际上胃癌患者的预后仍未得到明显改善。因此,探索与肿瘤侵袭转移有关的分子调控机制,寻找有助于胃癌诊断和预后的生物标志物,不仅可以帮助临床医生判断预后,制定个体化治疗方案,而且有助于明确胃癌发生发展的机制,寻找潜在的治疗靶点。胞外分泌复合体是由 Sec3,Sec5,Sec6,Sec8,Sec10,Sec15,Exo70 和 Exo84组成的蛋白八聚体,它通过不同的亚基分别与囊泡和细胞膜的相互作用,把囊泡锚定到细胞膜上并促进其融合,最终使囊泡转运的物质如蛋白质和磷脂等融合到细胞膜上或分泌到细胞外,从而影响一系列细胞活动,包括细胞极性的建立、细胞生长、细胞粘附、细胞迁移和肿瘤侵袭等,其中Exo70亚基是介导囊泡与目的质膜锚定的关键因素。近期的研究表明,Exo70与肿瘤发生发展的几个关键阶段有关。Exo70异构体的差异表达在上皮-间充质转化（EMT）中起着重要作用,并促进侵袭性伪足形成和细胞侵袭。Exo70可通过与肌动蛋白相关蛋白2/3（Arp2/3）复合体相互作用,诱导肌动蛋白骨架聚合,促进侵袭性伪足形成及基质金属蛋白酶（MMP）分泌,降解细胞外基质（ECM）,参与肿瘤细胞侵袭。在肝癌细胞中,Exo70作用于肝细胞核因子4α（HNF4α）的下游,通过增加细胞分裂周期蛋白2（Cdc2）表达而促进G2/M周期转换。此外,Exo70在结肠癌患者中的过表达被证明与临床不良预后有关。这些发现表明Exo70在肿瘤增殖和迁移的过程中起着重要的作用。然而到目前为止,我们对Exo70在肿瘤发生和发展中的作用仍知之甚少,Exo70在胃癌组织中的表达情况以及预后价值尚未见报道。本研究旨在探讨Exo70在胃癌患者中的表达水平,并探讨其对胃癌预后的影响。使用Oncomine及Kaplan-Meier Plotter数据库分析Exo70 mRNA在胃癌患者中的表达和预后价值。并通过对90个石蜡包埋的Ⅲ期胃癌组织进行了免疫组织化学染色,验证Exo70蛋白的表达水平,进一步分析Exo70表达与Ⅲ期胃癌患者临床病理因素的关系以及Exo70的预后价值。材料和方法1.实验材料1.1胃癌组织标本与临床资料收集中山大学肿瘤防治中心2003年至2006年期间经外科手术切除并经病理确诊的Ⅲ期胃癌组织标本及配对的癌旁正常胃组织共90例。收集其相关的临床资料,包括性别、年龄、术前血清CEA水平、肿瘤位置、肿瘤大小、Borrmann分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移、复发情况、无病生存期与总生存期等。所有患者均接受了根治性切除术,术前未接受过化疗或放疗,术后接受6个月以5-氟尿嘧啶为基础的辅助化疗。1.2试剂兔抗Exo70多克隆抗体（12014-1-AP）购自PROTEINTECH公司,免疫组化试剂盒（KIT-9730）、DAB染色剂（DAB0031）购自福建迈新生物技术公司。1.3肿瘤基因组数据库Oncomine数据库检索及提取数据,输入基因“ExoC7”,选择“差异分析”模块,分析ExoC7 mRNA在胃癌与正常胃组织中的表达差异。Kaplan-Meier Plotter数据库绘制OS曲线评价Exo70 mRNA表达与胃癌患者预后的关系。2.实验方法2.1免疫组化采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法检测,操作按SP试剂盒说明书进行,石蜡切片60℃烤片2h,常规二甲苯脱蜡、梯度酒精水化,0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）微波中高火进行抗原修复15min,3%过氧化氢常温孵育30 min阻断内源性过氧化氢酶,动物非免疫血清（羊）常温孵育2 h封闭非特异性抗原,Exo70一抗（1:100）4℃孵育过夜,复温后用生物素标记的羊抗鼠/兔Ig G（1:500）孵育1 h,链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶孵育30 min,DAB显色,苏木素复染,常规脱水,中性树胶封片。2.2结果判定在普通光学显微镜下进行阅片评分,由两位有经验的病理科医师独立阅片。在400倍光镜下随机选择10个不同视野,采用半定量方式进行评分。根据每个视野中阳性细胞数的百分比（≤5%,0分;5-25%,1分;25-50%,2分;50-75%,3分;>75%,4分）和阳性细胞的染色强度（无着色,0分;弱,1分;中等,2分;强,3分）相乘得到免疫反应评分（IRS）,取10个视野的平均分。0分视为阴性（-）;1～4分视为弱阳性（+）;5～8分视为中等阳性（++）;9～12分视为强阳性（+++）。3.统计分析采用SPSS 18.0统计软件分析处理数据,计量资料采用均数±标准差表示,计量资料采用非参数检验分析组间差异。通过卡方检验分析Exo70表达与临床病理因素之间的关系。Kaplan-Meier法进行单因素生存分析,COX回归模型进行多因素生存分析,消除各个变量间相互作用,确定独立预后因素。检验水准P<0.05时表示差异具有统计学意义。研究结果1.Oncomine数据库预测,Exo70 mRNA在胃癌组织中的表达水平高于正常胃组织（P<0.05）。Kaplan-Meier Plotter数据库生存分析显示,Exo70 mRNA高表达的胃癌患者的OS 比Exo70 mRNA低表达的患者的OS显著降低（P<0.001）。2.90例胃癌组织和配对的癌旁组织的免疫组织化学染色结果显示,Exo70蛋白主要定位于胃癌细胞和正常胃粘膜细胞的细胞质和细胞膜中,胃癌组织中Exo70蛋白的表达水平显着高于正常胃组织（P<0.001）。3.分析Exo70蛋白表达差异与胃癌患者临床病理因素的关系,结果显示,男性胃癌患者更易出现Exo70的过表达（P<0.001）。Exo70的表达与Ⅲ期胃癌患者的年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤分化程度、Borrmann分型、血清CEA水平、淋巴结转移等临床病理因素无明显关系（P>0.05）。4.单因素生存分析显示,与Exo70蛋白弱阳性及中等阳性表达的患者相比,Exo70蛋白强阳性表达的胃癌患者的OS和DFS均明显降低（p<0.05）。男性患者的OS较女性低（p<0.05）。将Exo70、性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度和淋巴结分期纳入COX回归多因素生存分析,结果显示,Exo70高表达是胃癌患者不良预后的唯一独立危险因素（p<0.05）。结论1.Ⅲ期胃癌组织中Exo70蛋白的表达水平高于正常胃组织。2.Exo70的过表达可作为胃癌患者不良预后的独立危险因素。3.Exo70有望成为胃癌患者的一个新的潜在治疗靶点。