冠状动脉微栓塞(Coronary Microembolization,CME)是急性冠状动脉综合征(Acute Coronary Syndromes,ACS)患者行经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous Coronary Intervention,PCI)过程中由于粥样硬化斑块碎屑、微栓子或嗜中性粒细胞-血小板聚集物进入冠状动脉微循环而导致的常见并发症。CME可导致心肌无复流(no-reflow)或慢血流(slow-reflow),是心肌再灌注治疗临床获益缺失的重要原因之一。CME发生后局部心肌组织收缩功能障碍,并可导致心律失常,严重影响患者心功能及预后。如何准确评估并有效防治CME成为心血管介入医师亟需解决的难题。我们前期研究发现,CME发生后心肌细胞凋亡及炎症反应是导致心功能受损的重要原因。近期有研究发现,微小核糖核酸(micro RNAs,miRs)及心肌细胞自噬可能在CME中同样发挥重要作用,但其具体分子机制目前还不清楚。MiRs是一类单链非编码小分子RNA,通过与靶m RNA 3′UTR完全或不完全互补结合,抑制m RNA翻译或促进m RNA降解进行转录后调节,在细胞生长、发育、炎症及凋亡等多种病理生理过程中发挥调控作用。大量研究已证实miRs广泛参与调控心血管疾病的发生发展过程,但其在CME后心脏自噬中的调控作用相关研究目前还较少。细胞自噬(autophagy)既是一种广泛存在的正常生理过程,又是细胞对不良环境的一种防御机制,参与多种疾病的病理过程。正常水平的自噬可以保护细胞免受环境刺激的影响,但自噬过度或不足均可导致疾病的发生。MiR-30家族在心肌细胞高丰度表达,目前研究已发现其在心肌肥厚、心肌梗死、心力衰竭及心肌纤维化等一系列心脏功能异常过程中发挥重要作用。此外,miR-30家族调控心肌自噬的研究近期也取得重要进展并引起广泛关注,但miR-30e-3p在CME后心肌自噬中的具体作用目前还不清楚。本研究通过构建大鼠CME动物模型,在器官及分子水平上观察CME后心肌自噬水平的变化规律和特点,探讨CME致心肌损伤及心功能降低和心肌自噬水平变化间的内在联系,揭示miR-30e-3p及心肌自噬在CME致心肌损伤中的生理及病理功能,明确其对心肌损伤的具体作用。第一部分冠状动脉微栓塞大鼠模型中心肌自噬和miR-30e-3p表达水平的变化目的:通过建立SD大鼠CME模型,观察心肌组织中miR-30e-3p与自噬水平的变化。方法:36只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组,n=6)和CME组(n=30),CME组根据不同观察时间点随机分为1h、3h、6h、9h、12h组,每组均为6只。经左心室注射含聚苯乙烯微球构建CME模型,Sham组注射等量生理盐水。应用心脏超声检测心功能,ELISA检测血清心肌肌钙蛋白I(c Tn I)水平,HE染色及HBFP染色观察并评估心肌微梗死面积,RT-q PCR检测miR-30e-3p的表达,Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ与p62的表达,透射电镜观察心肌组织自噬泡。结果:1.与Sham组比较,CME组6h、9h与12h亚组心功能显著降低,表现为左室收缩功能障碍和左室扩张:左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、心排血量(CO)下降,同时左室舒张期末径(LVIDd)、左室收缩期末径(LVIDs)升高(均P<0.05)。2.与Sham组相比,CME后除1h亚组外,其余各组c Tn I均显著升高,且9h达峰值,差异具有统计学意义(均P<0.05)。3.与Sham组相比,CME组心肌组织HE染色结果可见微栓塞球周围心肌细胞核溶解或消失,并伴有大量炎性细胞浸润;HBFP染色结果可见微梗死区心肌红染,周围正常心肌黄染,胞核蓝色,局灶性分布多发微梗死灶。4.与Sham组相比,CME后大鼠6h、9h、12h亚组心肌组织miR-30e-3p表达水平显著降低(P<0.05)。5.与sham组相比,CME后1h、3h、6h亚组心肌组织中LC3Ⅱ蛋白表达水平显著升高,p62蛋白表达水平显著下降;9h、12h亚组心肌组织中LC3Ⅱ蛋白表达水平显著下降,p62蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。6.透射电镜观察Sham组心肌肌原纤维结构清晰,线粒体膜完整;CME组可见心肌肌原纤维断裂,心肌细胞肌丝排列紊乱,线粒体肿胀,可见自噬泡典型双层膜结构。结论:CME大鼠模型中心肌组织miR-30e-3p表达水平下调,心肌自噬被抑制,心脏功能下降。第二部分MiR-30e-3p靶向Egr-1调控自噬介导冠状动脉微栓塞致心肌损伤目的:研究CME后心肌自噬水平与miR-30e-3p表达水平间的关系,阐明心肌组织中miR-30e-3p是否靶向Egr-1调控自噬介导CME致心肌损伤。方法:30只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、CME组、CME+miR-30e-3p组、CME+miR-NC组、CME+miR-30e-3p+3-MA组,每组6只。Sham组与CME组经尾静脉泵入0.5ml生理盐水,其余干预手段同实验第一部分;CME+miR-30e-3p组与CME+miR-NC组分别经尾静脉转染装载有miR-30e-3p和miR-NC的重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 9,r AAV9)两周后,建立CME模型;CME+miR-30e-3p+3-MA组建立CME模型前30min经腹腔注射3-MA,剂量为30mg/kg,其余干预同CME+miR-30e-3p组。应用双荧光素酶报告基因系统验证Egr-1是miR-30e-3p的靶基因,应用心脏超声检测心功能,ELISA检测血清心肌肌钙蛋白I(c Tn I)水平,HE染色及HBFP染色观察并评估心肌微梗死面积,RT-q PCR检测miR-30e-3p与Egr-1 m RNA的表达水平,Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62、Beclin-1及靶蛋白Egr-1的表达水平,透射电镜观察心肌组织自噬泡。结果:1.生物信息学数据库预测分析结果提示Egr-1可能是miR-30e-3p潜在靶基因之一;荧光素酶活性检测结果显示,miR-30e-3p可以与Egr-1 3′UTR序列直接结合从而导致荧光素酶活性降低;而Egr-1 3′UTR突变结合位点对荧光素酶活性没有影响。2.与Sham组比较,CME组miR-30e-3p表达水平显著下调;与CME组比较,CME+MIR组miR-30e-3p表达水平显著上调,而CME+NC对照组未发生明显变化;与Sham组比较,CME组Egr-1 m RNA表达水平显著上调,其余三组同样显著上调。3.与Sham组对比,CME组大鼠心功能显著降低;与CME组对比,r AAV9转染miR-30e-3p组大鼠心功能显著好转,而r AAV9转染miR-NC对照组大鼠心功能未见明显变化,主要心功能检测指标表现为:LVEF、LVFS、CO上升,同时LVIDd、LVIDs下降;与r AAV9转染miR-30e-3p组对比,3-MA预处理组大鼠心功能显著降低。4.与Sham组相比,CME组c Tn I水平显著升高;心脏高表达miR-30e-3p后,大鼠血清c Tn I水平相对单纯CME组显著降低;3-MA预处理组c Tn I水平相对高表达miR-30e-3p组显著升高。5.除Sham组外,其余各组心肌组织HE染色结果可见微栓塞球周围心肌细胞核溶解或消失,心肌组织水肿变性并伴有大量炎性细胞浸润;HBFP染色结果可见微梗死区心肌红染,周围正常心肌黄染,胞核蓝色,局灶性分布多发微梗死灶;CME组、CME+MIR组、CME+NC组、CME+MIR+3-MA组心肌组织微梗死面积分别为(15.11±2.72)%、(7.43±2.01)%、(14.66±2.37)%、(12.34±2.55)%;与CME组对比,CME+MIR组心肌微梗死面积显著减少(P<0.05);与CME+MIR组对比,CME+NC组和CME+MIR+3-MA组心肌组织微梗死面积显著增加(P<0.05)。6.与sham组相比,CME组心肌组织中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平显著下降,同时p62、Egr-1蛋白表达水平显著升高;与CME组对比,CME+miR-30e-3p组心肌组织中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平显著增加,同时p62、Egr-1蛋白表达水平显著降低;与CME+miR-30e-3p组对比,CME+NC组和CME+MIR+3-MA组心肌组织LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平显著下降,同时p62蛋白表达水平显著升高,CME+NC组心肌组织中Egr-1表达水平显著增加,而CME+MIR+3-MA组Egr-1表达水平未见明显变化。7.透射电镜观察Sham组心肌肌原纤维结构清晰,线粒体膜完整;其余各组可见心肌肌原纤维断裂,心肌细胞肌丝排列紊乱,线粒体肿胀变形;与CME组对比,高表达miR-30e-3p后可见心肌组织自噬泡数量明显增加,自噬被激活,而使用自噬抑制剂3-MA后,心肌组织自噬泡数量减少,自噬被抑制。结论:1.Egr-1是miR-30e-3p的靶基因之一;2.CME后心肌自噬水平与miR-30e-3p表达水平密切相关;3.miR-30e-3p部分通过Egr-1调控自噬介导CME致心肌损伤。第三部分Egr-1/Bim/Beclin-1信号通路在冠状动脉微栓塞致心肌损伤中的作用机制研究目的:研究Egr-1/Bim/Beclin-1信号通路在冠状动脉微栓塞中的激活情况及其介导心肌损伤的具体作用机制。方法:30只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、CME组、CME+Egr-1sh RNA组、CME+Control sh RNA组、CME+Egr-1 sh RNA+3-MA组,每组6只。Sham组与CME组经尾静脉泵入0.5ml生理盐水,其余干预手段同实验第一部分;CME+Egr-1 sh RNA组与CME+Control sh RNA组分别经尾静脉转染装载有Egr-1 sh RNA和Control sh RNA的重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 9,r AAV9)两周后,建立CME模型;CME+Egr-1 sh RNA+3-MA组建立CME模型前30min经腹腔注射3-MA,剂量为30mg/kg,其余干预同CME+Egr-1 sh RNA组。应用心脏超声检测心功能,ELISA检测血清心肌肌钙蛋白I(c Tn I)水平,HE染色及HBFP染色观察并评估心肌微梗死面积,TUNEL凋亡染色评估心肌细胞凋亡指数,RT-q PCR检测Egr-1 m RNA、Bim m RNA与Beclin-1 m RNA的表达水平,Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62、Beclin-1及Egr-1/Bim/Beclin-1通路蛋白及凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3的表达水平,透射电镜观察心肌组织自噬泡数量变化。结果:1.与Sham组对比,CME组大鼠心功能显著降低;与CME组对比,r AAV9转染Egr-1 sh RNA组大鼠心功能显著改善,而r AAV9转染Control sh RNA对照组大鼠心功能未见明显变化;主要心功能检测指标表现为:LVEF、LVFS、CO上升,同时LVIDd、LVIDs下降;与r AAV9转染Egr-1 sh RNA组对比,3-MA预处理组大鼠心功能显著降低。2.与Sham组相比,CME组c Tn I水平显著升高;心脏下调Egr-1表达后,大鼠血清c Tn I水平相对单纯CME组显著降低;3-MA预处理组c Tn I水平相对下调Egr-1表达组显著升高。3.CME建模后微栓塞球周围心肌细胞核溶解或消失,心肌组织水肿变性并伴有大量炎性细胞浸润,而sham组未见明显异常;HBFP染色结果可见微梗死区心肌红染,周围正常心肌黄染,胞核蓝色,局灶性分布多发微梗死灶;CME组、CME+Egr-1 sh RNA组、CME+Control sh RNA组、CME+Egr-1 sh RNA+3-MA组心肌组织微梗死面积分别为(16.28±2.43)%、(6.52±1.91)%、(15.33±2.02)%、(11.54±1.85)%;与CME组对比,CME+Egr-1 sh RNA组心肌微梗死面积显著减少(P<0.05);与CME+Egr-1 sh RNA组对比,CME+Control sh RNA组和CME+Egr-1sh RNA+3-MA组心肌组织微梗死面积显著增加(均P<0.05)。4.Sham组、CME组、CME+Egr-1 sh RNA组、CME+Control sh RNA组、CME+Egr-1 sh RNA+3-MA组微梗死灶边缘区心肌细胞凋亡指数分别为(3.9±1.4)%、(29.6±3.8)%、(14.1±2.7)%、(28.3±3.5)%、(23.5±3.1)%;与Sham组比较,CME组微梗死灶边缘区心肌细胞凋亡指数显著增加(P<0.05);与CME组比较,CME+Egr-1 sh RNA组微梗死灶边缘区心肌细胞凋亡指数显著减少(P<0.05);与CME+Egr-1 sh RNA组比较,CME+Control sh RNA组和CME+Egr-1 sh RNA+3-MA组微梗死灶边缘区心肌细胞凋亡指数显著增加(P<0.05)。5.与Sham组比较,CME组Egr-1 m RNA与Bim m RNA表达水平显著上升,Beclin-1 m RNA表达水平显著下降(均P<0.05);与CME组比较,CME+sh RNA组Egr-1 m RNA与Bim m RNA表达水平显著下降,Beclin-1m RNA表达水平显著上升(均P<0.05);与CME+sh RNA组比较,CME+sh RNA+3-MA组Beclin-1 m RNA表达水平显著降低(P<0.05)。6.与Sham组相比,CME组心肌组织中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平显著下降,同时p62、Egr-1、Bim、C-caspase 3蛋白表达水平显著升高(均P<0.05);与CME组对比,CME+sh RNA组心肌组织中LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平显著增加,同时p62、Egr-1、Bim、C-caspase 3蛋白表达水平显著降低(均P<0.05);与CME+sh RNA组对比,CME+Control组和CME+sh RNA+3-MA组心肌组织LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平显著下降,同时p62、C-caspase 3蛋白表达水平显著升高,CME+Control组心肌组织中Egr-1、Bim蛋白表达水平显著增加,而CME+sh RNA+3-MA组Egr-1、Bim蛋白表达水平未见明显变化(均P<0.05)。7.透射电镜下可见Sham组大鼠心肌细胞肌原纤维结构清晰,线粒体膜完整;其余各组可见心肌肌原纤维断裂,心肌细胞肌丝排列紊乱,线粒体肿胀变形;与CME组对比,干扰Egr-1表达后可见心肌组织自噬泡数量明显增加,自噬被激活,而使用自噬抑制剂3-MA预处理后,心肌组织自噬泡数量减少,自噬被抑制。结论:1.Egr-1/Bim/Beclin-1信号通路在CME后激活;2.Egr-1/Bim/Beclin-1信号通路通过调控心肌细胞自噬及凋亡参与CME致心肌损伤。