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玉米是世界上最重要的粮食作物之一,玉米籽粒中淀粉的品质与玉米的品质息息相关。大量实验研究结果表明,作物籽粒的淀粉含量与淀粉合成关键酶活性存在着十分密切的关系。淀粉合成相关酶包括腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶以及淀粉磷酸化酶等。目前对于这些关键酶基因表达的研究比较深入,但对于这些关键基因的表达调控机理的研究相对有限。转录调控通过调节淀粉生物合成相关酶基因的表达水平,进而调控淀粉的生物合成。因此,研究玉米淀粉生物合成过程中的分子调控机制具有重要意义。本课题组前期预测了一些转录因子参与调控淀粉合成关键酶基因。本实验将预测获得的zmmads11突变体经过多代回交、自交得到纯合的突变体,通过突变体DNA突变位点的PCR检测,籽粒RNA的半定量检测,结合zmmads11纯合突变体表型检测,鉴定出了zmmads11纯合突变体;通过实时定量PCR分析淀粉相关酶基因在野生型和zmmads11纯合突变体中表达的差异,酵母单杂交实验验证淀粉相关酶基因启动子和ZmMADS11的结合作用,分析了ZmMADS11对淀粉合成相关酶基因是直接还是间接调控;结合高通量测序分析野生型和纯合突变体15DAP胚乳中基因表达差异情况,并在大肠杆菌中表达了ZmMADS11蛋白,在体外尝试进行了ChIP-Seq实验,具体实验结果如下:1、Mu转座子插入的zmmads11突变体与野生型W22经过6代回交后自交获得zmmads11纯合突变体,用SLS法提出幼嫩玉米叶片DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,鉴定出纯合突变体。2、由于纯合突变体花粉败育,我们对杂合体自交后通过成熟期胚DNA突变位点检测,筛选出了纯合突变籽粒和野生型籽粒。利用Megazyme总淀粉测定试剂盒检测去胚后籽粒中总淀粉含量,发现野生型中总淀粉含量为70.83%,zmmads11纯合突变体中总淀粉含量为78.12%,淀粉含量上升了7.29%。说明ZmMADS11基因的突变对总淀粉的合成产生了影响;利用Megazyme抗性淀粉测定试剂盒测抗性淀粉后发现野生型W22和zmmads11突变体纯合籽粒中抗性淀粉含量差异不显著,说明ZmMADS11基因的突变对抗性淀粉的合成没有显著影响。3、提取纯合突变体和野生型15DAP胚乳总RNA,半定量PCR鉴定出ZmMADS11在突变体胚乳中没有表达;实时荧光定量PCR分析淀粉相关酶基因:AGPISI(SH2)、AGPSIA(BT2)、SBEI、SBE2B、ISAI、PUL、PHOL、BTI在野生型和zmmads11突变体15DAP胚乳中表达差异情况,结果表明zmmads11突变体中SSI、SSIII的表达量极显著高于野生型;酵母单杂交实验验证转录因子ZmMADS11与淀粉合成相关酶启动子的结合作用,结果表明ZmMADS11与SSI、SSIII启动子没有直接作用。4、将纯合突变体和野生型15DAP胚乳进行转录组分析,以log2为阈值,发现在zmmads11纯合突变体中有117个基因上调,62个基因下调,其中与淀粉和糖代谢途径中有两个基因上调,分别为β-葡萄糖苷酶和海藻糖磷酸酶,一个基因下调为β-呋喃果糖苷酶。内质网蛋白加工途径中有十个基因上调,一个基因下调,均为热激蛋白。推测zmmads11纯合突变体中淀粉含量的增加与淀粉和糖代谢途径中相关酶基因表达量提高或内质网蛋白加工过程中相关酶蛋白稳定性增加有关。5、在大肠杆菌当中表达了ZmMADS11蛋白与DNA相结合的M结合域,将玉米基因组DNA超声破碎后,在体外尝试进行了ChIP-Seq实验,分析ZmMADS11的调控网络途径。