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目的:构建抗黑色素瘤免疫细胞因子ScFv-mTNF-α,在大肠杆菌中表达并纯化具有黑色素瘤特异性结合活性和杀伤活性的融合蛋白,为黑色素瘤的抗体导向治疗打下基础。方法:为了避免使用天然型TNF-α所造成的强烈的副作用,我们尝试用高生物学活性、低毒性的突变型TNF-α(mTNF-α)将天然型TNF-α替代,与抗黑色素瘤单链抗体构建新型、高效、低毒的抗黑色素瘤免疫细胞因子原核表达载体pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α,待鉴定正确后,通过在大肠杆菌中诱导表达、纯化,用制备的融合蛋白在体外对L929细胞进行TNF活性的检测,对B16-F10黑色素瘤细胞进行体外杀伤实验,在体内对荷黑色素瘤Balb/c小鼠进行导向治疗研究,以期获得具有临床应用潜能的抗黑色素瘤免疫细胞因子。首先鉴定本室保存的两个质粒pGEX-4T-1/ScFv和pGEX-4T-1/mTNF-α,并对其进行测序,用获得的测序结果推导出对应的氨基酸序列,查阅文献获得linker序列,将模拟得到的理论融合蛋白片断通过Insight II软件,采用同源建模、分子力学和分子动力学等方法预测蛋白质三维结构。设计含有限制性内切酶和linker序列的引物并分别扩增ScFv基因和mTNF-α基因,用重叠延伸PCR方法把ScFv基因与mTNF-α基因进行融合,将所获得的免疫细胞因子基因克隆入带GST标签的质粒pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α,用限制性内切酶酶切分析、DNA序列测定、SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白原核表达载体构建和表达的情况。IPTG诱导表达之后的表达产物经包涵体的纯化→变性→复性→透析→浓缩→亲和层析后,得到比较纯的ScFv-mTNF-α的抗黑色素瘤的融合蛋白。采用MTT法,标准曲线法用小鼠成纤维细胞L929检测免疫细胞因子的TNF-α活性;MTT法检测免疫细胞因子对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞株的杀伤作用;免疫荧光测定ScFv对黑色素瘤细胞的特异结合活性;体内实验用Balb/c小鼠尾静脉注射小鼠黑色素瘤细胞株B16-F10,实验分为PBS组、ScFv组、mTNF-α组、ScFv-mTNF-α四组,每组8只动物。接种一天后开始尾静脉注射给药,连续给药一个星期,每24h一次,给药量为60ug/只·天,一周后解剖各组小鼠进行比较,观察小鼠肺部黑色素瘤转移的情况。结果:质粒pGEX-4T-1/ScFv经过测序后ScFv基因长732bp,基因内无终止码,为开放读框,编码244个氨基酸,含六个CDR区,并含有维持抗体结构所必需的四个半胱氨酸。计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性,表明所克隆基因为功能性重排小鼠抗体可变区基因。mTNF-α基因与天然型TNF-α基因比较,缺少了7个N端氨基酸的同时Pro8Ser9Asp10改也变为ArgLysArg,C端第157位Leu由疏水性氨基酸Phe替代。根据文献确定linker序列为GTGGGS,将ScFv与mTNF-α基因融合后对获得的理论融合蛋白的序列进行三级结构预测,结果显示融合蛋白单体和形成三聚体后的ScFv与mTNF-α彼此功能结构域不会互相影响。PCR扩增出ScFv和mTNF-α基因片断,通过OE-PCR方法将两个片断进行融合,构建了原核表达质粒pGEX-4T-1/ScFv-mTNF-α,转化大肠杆菌TG1,经IPTG诱导在分子量为69KD处有一条明显的新生蛋白带,用抗GST单抗进行Western blot分析也证实了该新生蛋白带为GST-ScFv-mTNF-α融合蛋白。表达产物经包涵体的纯化→变性→复性→透析→浓缩→亲和层析→凝血酶切→亲和层析后,得到比较纯的ScFv-TNF-α的抗黑色素瘤的免疫细胞因子。在ScFv-mTNF-α的MTT实验中,我们发现ScFv-mTNF-α对TNF敏感的小鼠成纤维细胞L929具有明显的杀伤作用,测得免疫细胞因子的mTNF-α活性为34382 u/mg,表明融合蛋白的mTNF-α端具有良好的生物学活性;免疫荧光实验结果表明scFv具有良好的与黑色素瘤细胞结合的特异性;对B16-F10细胞株的杀伤实验表明免疫细胞因子具有体外结合并杀伤黑色素瘤细胞的特性,杀伤效应存在浓度依赖关系,即融合蛋白浓度越大,对细胞的杀伤越强,浓度在100μg/ml时对B16-F10细胞的杀伤效果最佳。B16-F10接种的各组Balb/c小鼠在经过一周的治疗后肺表面均没有明显的黑色素瘤转移结节,PBS对照组也没有发现肺部肿瘤转移灶形成,可能的原因是B16-F10对Balb/c小鼠有较强的免疫原性。因此我们将实验进行了改进,改用C57/BL6小鼠,延长实验周期,即延长肿瘤转移后的生长时间,再对其采用融合蛋白进行治疗,观察融合蛋白在体内对黑色素瘤的杀伤效应。实验正在进行中。结论:成功构建了抗黑色素瘤免疫细胞因子pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α原核表达载体,用获得的融合蛋白进行体内外活性研究,实验结果表明免疫细胞因子ScFv-mTNFα具有较好的体外生物学活性。