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目的：
1.通过收集温州地区聋哑学校的学生和温州医学院附属第二医院耳鼻喉科的门诊患者的临床资料,了解温州地区耳聋的发病情况。
2.通过对耳聋患者线粒体tRNALeu(UUR)、tRNAlle和tRNALysDNA突变的筛查,深入地研究线粒体DNA突变与耳聋的关系,发现新的与耳聋相关的线粒体DNA突变。
3.对两个携带线粒体tRNAIleA4317G突变的中国汉族耳聋家系的临床、遗传和分子生物学特征进行分析,为耳聋基因的调查、耳聋诊断及预防提供分子流行病学数据。
方法：
1.采集来自浙江温州地区聋哑学校的学生和温州医学院附属第二医院耳鼻喉科的门诊耳聋患者血液标本226例。
2.采集温州正常对照人群血液标本209例。
3.提取所采集血液标本的基因组DNA。
4.用聚合酶链反应(PCR)扩增技术对线粒体tRNALeu(UUR)、tRNAIle和tRNALys区域进行点突变筛查。
5.对PCR产物纯化后直接进行测序分析。
6.对发现的tRNAIleA4317G突变进行该位点的二级结构分析和保守性分析。
7.对两个携带线粒体tRNAIleA4317G突变的中国汉族耳聋家系FE163家系和RA109家系进行系谱分析,收集临床相关资料,对该两个家系进行听力学检查,分析氨基糖甙类抗生素对这两个家系耳聋外显率的影响。
8.对FE163家系和RA109家系的先证者进行线粒体全基因组序列测序分析,分析其线粒体单体型。
9.对FE163家系和RA109家系成员的GJB2基因的编码区进行突变检测,分析GJB2对这两个家系耳聋外显率的影响。
结果：
1.对已收集的226例温州地区聋哑学校学生和温州医学院附属第二医院耳鼻喉科的门诊患者进行线粒体tRNALeu(UUR)、tRNAiLE和tRNALys基因突变的筛查,共筛查出2名耳聋患者携带mtDNA tRNAIleA4317G这个突变,突变频率为0.88％。
2.在采集的209例温州正常对照人群的线粒体DNA中没有发现tRNAIleA4317G突变。
3.对发现的线粒体tRNAIleA4317G突变的二级结构分析发现该突变影响了tRNAIle的氨基酰化程度,导致tRNA的不稳定,影响蛋白质的合成。而对该位点的包括人类在内的14种灵长类动物物种间的保守性分析发现线粒体tRNAIle4317位点的保守性指数为85.7％,是一个保守性很高的位点。
4.对两个携带线粒体tRNAIleA4317G突变的中国汉族耳聋家系FE163家系和RA109家系进行系谱、临床表现分析,发现这两个家系听力损失的外显率和表现度都非常高,其中FE163家系包括氨基糖甙类抗生素耳聋和排除氨基糖甙类抗生素耳聋时外显率分别为89.5％和87.5％,而RA109家系包括氨基糖甙类抗生素耳聋和排除氨基糖甙类抗生素耳聋时外显率分别为88.9％和87.5％。临床表现型的评估表明,这两个家系中的患者的听力损失的类型不一,RA109家系中的两名母系成员临床表现除了感音神经性耳聋还有高血压症状。
5.对FE163家系和RA109家系的先证者进行线粒体全基因组序列测序分析,FE163家系和RA109家系的线粒体DNA都属于东亚单体型,分别是B4c和D4e1a。FE163家系的线粒体DNA突变中除了tRNAIleA4317G同质突变外还存在12SrRNA A1555G同质突变。在这两个家系的线粒体DNA中,我们没有发现以往报道影响耳聋外显率的线粒体DNA多态位点,但在FE163家系中发现了只有C3571T(L89F)和8573A(G16D)这两个错义多态在进化上是高度保守的,但其具体作用还有待于进一步的试验研究证实。
6.对FE163家系和RA109家系的家系成员的GJB2基因的编码区进行突变检测,FE163家系成员GJB2基因的编码区未发现突变和多态性位点,而在RAl09家系中,先证者RA109-Ⅲ-1 GJB2基因的编码区发现235de1C和512insAACG的复合杂合突变,其母亲RA109-Ⅱ-2和弟弟RA109-Ⅲ-2 GJB2基因的编码区发现512insAACG杂合突变,其父亲RA109-Ⅱ-1 GJB2基因的编码区发235de1C杂合突变。
结论：
1.我们对已经收集的226例温州地区聋哑学校学生和温州医学院附属第二医院耳鼻喉科的门诊患者进行线粒体tRNALeu(UUR)㈣、tRNAIle和tRNLys基因突变的筛查,共筛查出2名耳聋患者携带mtDNA tRNAIleA4317G突变,而在209名温州正常对照的线粒体DNA中并没有发现该突变,以及对该位点的二级结构分析和保守性分析,提示A4317G突变很可能是一个耳聋相关的致病性突变。
2.FE163家系和RA109家系母系成员的临床表型不同(包括听力损失程度和听力曲线不同类型在内)以及包括氨基糖甙类抗生素耳聋和排除氨基糖甙类抗生素耳聋时外显率的不同,表明氨基糖甙类抗生素作为修饰因子在该家系的耳聋表型上起了一定的作用。
3.FE163家系的线粒体DNA突变中除了tRNAIleA4317G同质突变外还存在12SrRNAA1555G同质突变,而该家系耳聋的高外显率远超过那些携带A1555G突变的家系的外显率,提示该家系的耳聋高外显率可能是tRNAIle A4317G突变和12SrRNAA1555G突变协同作用造成的。
4.GJB2基因不影响FE163家系的耳聋外显率,但可能对RA109家系先证者耳聋的外显表达起一定的作用,加重其听力损失程度。