红景天苷改善内皮功能及其抗动脉粥样硬化的作用及机制目的：红景天苷是天然植物红景天(Rhodiola Rosed)的主要有效成分。已有研究提示红景天苷具有抗动脉粥样硬化的作用,但其具体机制不明确。血管内皮功能紊乱在动脉粥样硬化发生发展中发挥重要作用,主要特征为内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)功能障碍。本课题拟研究红景天苷能否通过激活eNOS,改善内皮功能从而发挥抗动脉粥样硬化的作用,并对eNOS上游相关的信号分子-AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)和磷脂酰肌醇-3激酶/苏氨酸激酶(Phosphatidylinositol3-kinase, PI3K/Akt)在其激活中的作用进行探讨。方法：(1)ApoE-/-小鼠适应性喂养一周,随机分为正常饮食组(normal diet, ND)和高脂饮食(high fat diet, HFD)组,喂养8周,随后将高脂饮食组随机分为高脂饮食组,红景天苷25mg/kg组和红景天苷50mg/kg组。红景天苷通过灌胃给药8周,正常饮食和高脂饮食组用生理盐水灌胃作为对照。在实验结束,禁食12小时,分离血清,检测生化指标；采用油红O染色观察整体主动脉及主动脉根部脂质沉积；采用离体血管灌流方法,检测小鼠血管舒张功能；采用蛋白印迹(Western Blot)方法检测apoE-/-小鼠主动脉中eNOS, AMPK和Akt的表达及磷酸化,同时检测apoE-/-小鼠肝脏中AMPK磷酸化及表达。(2)大鼠胸主动脉舒张功能检测：取Wistar大鼠胸主动脉,离体血管灌流方法检测血管舒张功能。(3)在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)中, Western Blot法检测红景天苷对eNOS, AMPK和Akt的磷酸化及表达的影响；用AMPK抑制剂(Compound C), AMPKal/2siRNA和PI3K抑制剂(LY294002)处理细胞,Werstern Blot法检测红景天苷对AMPK,Akt及eNOS激活的因果关系；高效液相色谱法检测红景天苷对细胞内ATP及AMP水平的影响；采用特异的荧光探针3-氨基4-氨甲基-2’,7’-双荧光素双乙酸酯(3-Amino,4-aminomethyl-2’,7’-difluorescein diacetate, DAF-FM-DA)、5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四乙基苯咪唑基羰花基碘化物(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-5, tetraethyl-benzimidazolyl-carbocyanine iodid, JC-1)和二氢溴乙菲啶(dihydroethidium, DHE)分别检测一氧化氮(nitric oxide, NO),线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△ψm)和超氧阴离子(superoxide anion, O2-)水平的变化。结果：(1)与高脂饮食组相比,红景天苷治疗组(50mg/kg)主动脉根部和整体主动脉脂质沉积显著减少,小鼠胸主动脉对乙酰胆碱的舒张反应性显著增加；与高脂饮食相比,红景天苷治疗组小鼠胸主动脉中eNOS ser1177位点磷酸化和表达水平显著增加,eNOS上游激酶AMPK和Akt磷酸化水平也显著增加；与高脂饮食相比,红景天苷治疗组血清总胆固醇(total cholesterol. TC),低密度胆固醇(low density lipoprotein cholesterol. LDL-c)水平显著降低,同时肝脏中AMPKthr172位点磷酸化和表达水平显著增加。(2)红景天苷对大鼠胸主动脉具有直接舒张作用,eNOS抑制剂L-NG-硝基精氨酸甲酯(NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester, L-NAME)和物理性去除内皮可以抑制红景天苷对血管的舒张作用。(3)在细胞实验中,红景天苷显著增加细胞eNOS ser1177位点的磷酸化水平,降低eNOS thr495位点的磷酸化水平,促进eNOS的表达。同时,DAF-FM-DA的荧光值也显著增加,这些作用均具有时间和浓度依赖性,说明红景天苷可以激活eNOS,促进NO释放。红景天苷促进eNOS上游激酶AMPK thr172位点的磷酸化,这种作用从5分钟开始,30分钟达到峰值,超过6小时后消失。而其对eNOS另一个上游激酶Akt ser473位点的磷酸化的促进作用从30分钟开始,持续至24小时。AMPK抑制剂Compound C和AMPK siRNA可以抑制红景天苷作用30分钟时对eNOS和Akt的磷酸化水平的增加作用,说明此时红景天苷对eNOS和Akt的激活作用依赖于AMPKo PI3K抑制剂LY294002抑制红景天苷作用24小时时对eNOS磷酸化和表达水平的增加作用。红景天苷适度降低线粒体膜电位,减少细胞内ATP的产生,增加细胞内AMP/ATP的比率。结论：红景天苷减轻HFD诱导的apoE-/-小鼠动脉粥样硬化,这与红景天苷调节血脂和激活eNOS,改善内皮功能有关。红景天苷通过轻度降低线粒体膜电位,增加AMP/ATP比率,激活AMPK/Akt/eNOS/NO信号通路而发挥改善内皮的作用。第二部分红景天苷抗H202所致血管内皮功能紊乱的作用及机制目的：活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加损害血管内皮细胞,导致血管血管内皮功能紊乱。作为ROS的主要来源,大量的研究证实线粒体功能紊乱在动脉粥样硬化中发挥了重要的作用。本部分拟研究红景天苷是否对过氧化氢(H2O2)所致的内皮依赖性血管舒张功能紊乱具有保护作用,并从线粒体生物合成,线粒体功能和核转录因子NF-κB等方面来探讨相关机制。方法：以过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)作为损伤因素,建立HUVECs氧化应激损伤模型。CCK-8试剂盒检测细胞活性,基于酶联免疫吸附测定法(ELISA)的方法分析红景天苷对NF-κB转录因子活性的影响；血管灌流法检测大鼠血管舒张功能；Western Blot方法检测eNOS, AMPK及Akt磷酸化及表达和线粒体生物合成相关蛋白PGC-1α和TFAM的表达；线粒体荧光探针Mito Tracker green检测红景天苷对线粒生物合成的影响；采用特异的荧光探针DAF-FM-DA, JC-1和DHE分别检测NO.△ψmm和02-水平的改变；高效液相色谱法检测细胞内ATP水平。结果：红景天苷(≤10μM)对细胞增殖没有显著影响,红景天苷预孵育可减轻H2O2对细胞增殖的抑制作用；红景天苷改善H2O2引起的大鼠胸主动脉内皮依赖性舒张功能紊乱,抑制H2O2引起的超氧阴离子和NO的释放。红景天苷抑制H202引起的eNOS, AMPK和Akt的激活；红景天苷抑制基础状态下NF-κB转录因子的活性,同时抑制0.1μMH2O2引起的NF-κB的激活,H2O2100μM抑制NF-κB的转录活性,红景天苷预孵育可以使其进一步降低；红景天苷刺激线粒体生物合成,上调线粒体生物合成相关因子PGC-1α和TFAM的表达,eNOS抑制剂L-NAME可以抑制这种作用；红景天苷预孵育减轻H2O2诱导的线粒体膜电位降低和ATP生成减少,改善H2O2诱导的线粒体功能紊乱。结论：红景天苷预处理可激活Akt/eNOS信号通路,促进NO产生。这种作用一方面上调PGC-1α和TFAM表达,促进线粒体生物合成,改善线粒体功能,从而抵抗H202诱导的线粒体功能紊乱；另一方面,抑制NF-κB转录因子活性。这两方面共同作用,抑制H2O2引起的细胞内氧化应激及其相关下游信号通路的过度激活,减轻H2O2对内皮细胞及内皮依赖性血管舒张功能的损伤。