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革兰氏阴性菌引起的疾病是家禽养殖业中的常见高发病,严重威胁着养禽业的健康发展以及公共卫生和食品安全。内毒素,又称脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）,是革兰氏阴性菌表面特有的组分,随菌体裂解释放进入肝脏,引起氧化应激反应,造成肝脏损伤。沉默信号调节因子1（Silent information regulator of transcription 1,SIRT1）是一种III类组蛋白去乙酰化酶,在肝脏高表达,参与调节细胞增殖、氧化应激、炎症等多种生理过程。但目前SIRT1对禽类肝脏氧化应激的调节作用及机制研究甚少。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的小分子非编码RNA,可以通过与靶基因3′UTR区结合调控基因的表达,在多种生物学过程中扮演重要角色。研究发现,miR-138-5p可以与SIRT1的3′UTR区结合,调节SIRT1的表达,但miR-138-5p对SIRT1的调控作用机制在禽类疾病中尚不十分明确。二氢杨梅素（Dihydromyricetin,DHM）,是从蛇葡萄中提取出的一种含量较高的天然黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化等多种药理作用,但具体作用机制复杂尚不清楚。因此,本课题以鸡原代肝细胞和雏鸡为研究对象,在LPS诱导肝脏氧化应激损伤的基础上,研究SIRT1在鸡肝脏氧化应激损伤中的作用,明确miR-138-5p调控SIRT1的分子机制,进而阐明DHM对鸡肝脏氧化应激损伤的干预作用和潜在的保护作用机制。本试验研究内容与结果如下:（1）DHM缓解LPS诱导鸡肝细胞氧化应激损伤的作用研究:在LPS诱导鸡肝细胞氧化应激损伤中,给予DHM处理,明确DHM对LPS诱导的鸡肝细胞氧化应激损伤的保护作用。结果显示,与LPS组相比,DHM极显著降低上清液中ALT、AST和LDH活性,极显著改变细胞SOD、CAT、GSH-Px、GSH、MDA和ROS水平,同时极显著降低IL-1β、IL-6和TNF-α表达及升高SIRT1表达（p＜0.01）。这些结果表明,DHM可以提高细胞抗氧化能力,清除ROS,抑制炎症因子释放,缓解LPS诱导的肝细胞氧化应激损伤,且促进SIRT1表达。（2）SIRT1在LPS诱导肝细胞氧化应激损伤中的作用研究:首先过表达SIRT1后检测鸡肝细胞氧化应激损伤相关指标的变化,以及SIRT1下游转录因子NOX4和PPARα表达。结果显示,与LPS组相比,过表达SIRT1可以极显著降低上清液中ALT、AST和LDH活性,提高细胞SOD、CAT、GSH-Px活性、GSH含量和PPARα表达,降低细胞MDA和ROS含量及IL-1β、IL-6、TNF-α和NOX4表达（p＜0.01）,表明SIRT1高表达可以缓解LPS诱导的肝细胞氧化应激损伤,抑制ROS产生,并影响下游转录因子的表达。为了进一步明确SIRT1影响ROS产生是否依赖于下游转录因子,我们应用了NOX4抑制剂（GKT137831）和PPARα激动剂（WY-14643）。结果显示,抑制NOX4或激活PPARα表达均明显降低了ROS水平。以上结果表明,SIRT1参与了LPS诱导的鸡肝细胞氧化应激损伤,过表达SIRT1可以通过调节NOX4和PPARα表达抑制ROS的生成,增强细胞抗氧化能力,减轻氧化应激损伤。（3）鸡肝细胞氧化应激损伤中miR-138-5p调控SIRT1的分子机制:首先,预测并挑选与SIRT1的3′UTR区结合的非编码RNA（miR-138-5p）,并检测LPS作用下miR-138-5p的表达;然后通过构建双荧光素酶报告基因质粒验证miR-138-5p与SIRT1的结合;进而应用miR-138-5p抑制剂（inhibitor）和模拟物（mimic）以及阴性对照转染鸡肝细胞,检测miR-138-5p和SIRT1的表达,分析miR-138-5p对SIRT1的调控作用。结果显示,与对照组相比,miR-138-5p在LPS组中高表达;miR-138-5p mimic可以极显著降低SIRT1野生型报告基因的荧光素酶活性（p＜0.01）,而对突变型报告基因的荧光素酶活性无明显调节作用,说明miR-138-5p能够与SIRT1直接结合。应用miR-138-5p inhibitor抑制miR-138-5p的表达后,SIRT1的表达极显著升高（p＜0.01）,应用miR-138-5p mimic过表达miR-138-5p后,可极显著降低SIRT1表达（p＜0.01）,表明miR-138-5p可以靶向负调控SITR1的表达。为进一步研究在氧化应激损伤中miR-138-5p调控SIRT1的作用机制,应用miR-138-5p inhibitor和SIRT1抑制剂（EX527）与LPS共处理细胞,检测SIRT1表达以及鸡肝细胞氧化应激损伤指标的变化情况。结果显示,抑制miR-138-5p表达可以上调SIRT1表达,降低上清液中ALT、AST和LDH活性,提高细胞SOD、CAT、GSH-Px活性和GSH含量,降低细胞MDA、ROS含量及IL-1β、IL-6和TNF-α表达（p＜0.01）;而抑制miR-138-5p表达后给予EX527处理,细胞抗氧化酶的活性降低,ROS水平升高,炎症因子释放增多,细胞损伤程度加重,说明miR-138-5p inhibitor对细胞的干预作用可以被EX527所抑制。以上结果表明,miR-138-5p和SIRT1均参与了LPS诱导的鸡肝细胞氧化应激损伤且miR-138-5p对SIRT1有负调控作用。（4）DHM通过miR-138-5p/SIRT1缓解鸡肝细胞氧化应激损伤的机制研究:首先应用DHM处理细胞再给予LPS,检测miR-138-5p的表达,分析DHM对miR-138-5p表达的影响。结果显示,与LPS组相比,给予DHM后miR-138-5p表达量极显著下降（p＜0.01）,表明DHM可以下调miR-138-5p的表达。再应用miR-138-5p inhibitor、miR-138-5p mimic和DHM给予细胞,探讨DHM缓解氧化应激损伤的作用是否依赖于miR-138-5p。结果显示,抑制miR-138-5p表达后,上清液ALT、AST、LDH活性极显著下降,细胞SOD、CAT、GSH-Px活性和GSH含量极显著上升,MDA、ROS含量及IL-1β、IL-6和TNF-α的表达极显著下降（p＜0.01）;在此基础上给予DHM,以上指标均无明显变化。过表达miR-138-5p后,细胞抗氧化酶的活性降低,ROS水平升高,炎症因子释放增多,细胞损伤程度加重;在过表达miR-138-5p基础上应用DHM极显著降低了由于过表达miR-138-5p所导致的上述指标改变。以上结果表明,DHM可以通过抑制miR-138-5p表达缓解LPS诱导的肝细胞氧化应激损伤。为了进一步明确DHM通过miR-138-5p/SIRT1缓解肝细胞氧化应激损伤中的机制,过表达miR-138-5p和SIRT1,再给予DHM处理,检测SIRT1表达以及鸡肝细胞氧化应激损伤情况。结果显示,与LPS+DHM组相比,过表达miR-138-5p后再给予DHM,上清液ALT、AST和LDH活性极显著上升,细胞SOD、CAT、GSH-Px活性和GSH含量极显著下降,MDA、ROS含量及IL-1β、IL-6和TNF-α的表达极显著上升（p＜0.01）,而SIRT1表达极显著下降（p＜0.01）,说明DHM对细胞损伤的保护作用及对SIRT1的上调作用被miR-138-5p过表达所阻断,因而DHM通过抑制miR-138-5p的表达减轻细胞损伤。进而在此基础上,过表达miR-138-5p和SIRT1后再给予DHM,SIRT1表达极显著上升,上清液ALT、AST和LDH活性极显著降低,抗氧化酶活性极显著升高,ROS水平和炎症因子的表达极显著下降（p＜0.01）,说明SIRT1过表达可以逆转DHM被miR-138-5p过表达所抑制的保护作用,DHM抑制miR-138-5p保护肝细胞损伤作用依赖SIRT1的参与。以上结果表明,DHM通过抑制miR-138-5p从而上调SIRT1的表达来缓解LPS诱导的肝细胞氧化应激损伤。（5）DHM缓解LPS所致雏鸡肝脏氧化应激损伤:通过检测氧化应激损伤相关指标、炎症因子、miR-138-5p和SIRT1的表达及病理组织学观察,明确DHM对LPS诱导的雏鸡肝损伤的保护作用。结果显示,LPS组血清ALT、AST、LDH活性极显著升高,肝脏SOD、CAT、GSH-Px、GSH、MDA、H2O2和NO的水平极显著变化,IL-1β、IL-6和TNF-α、miR-138-5p表达均极显著增加且SIRT1的表达极显著下降（p＜0.01）;DHM处理降低肝细胞损伤程度,提高抗氧化酶活性,抑制炎症因子和miR-138-5p表达,以及升高SIRT1表达。病理组织学检查结果显示,LPS组肝索紊乱,有明显的炎性细胞浸润并伴有出血点;DHM处理肝索结构完整,炎性细胞和出血点较少。透射电镜结果显示,LPS组细胞核核膜间隙增大,内质网和线粒体出现大量空泡,胞内糖原减少,DHM处理内质网和线粒体的空泡减少,肝细胞结构恢复正常。以上研究表明DHM可以增强肝脏抗氧化能力,抑制炎症反应,抑制miR-138-5p表达且促进SIRT1表达,从而改善LPS诱导的雏鸡肝脏氧化应激损伤。综上所述,在LPS诱导的鸡肝细胞氧化应激损伤中SIRT1具有重要作用,过表达SIRT1可以通过调节NOX4和PPARα的表达抑制ROS的生成,增强细胞抗氧化能力;miR-138-5p和SIRT1参与了LPS诱导的鸡肝细胞氧化应激损伤机制且miR-138-5p对SIRT1具有负调控作用;DHM可以通过调控miR-138-5p/SIRT1,提高机体的抗氧化功能,抑制炎症反应,缓解LPS诱导的鸡肝脏氧化应激损伤。本研究首次在鸡肝脏氧化应激损伤中开展了miR-138-5p调控SIRT1的分子机制研究,并探索了DHM干预LPS致鸡肝脏氧化应激损伤的潜在机制,为DHM在兽医临床上的应用提供理论基础和科学依据,为新药的研发提供新靶点和新思路。