血管生成素(ANG)是最初从人结肠癌细胞系HT-29培养液中分离纯化得到的生长因子，因其具有强烈的促血管新生活性而得名。它属于单链碱性蛋白质，由123个氨基酸残基组成，分子量约为14 kDa。目前，已经知道血管生成素作为一个重要的血管生成因子，在肿瘤血管生成的过程中发挥重要作用，它可激活细胞外周的蛋白酶并降解基底膜和胞外基质、可活化信号通路、可进入靶细胞的细胞核并促进rRNA转录，从而促进血管内皮细胞及平滑肌细胞的迁移、增殖和粘附。但从总体上看，对血管生成素促进血管新生的分子机制认识还不全面，许多方面尚待深入研究。 蛋白质是生命活动的体现者和执行者，蛋白质-蛋白质之间的相互作用几乎参与了每一个生物学过程，并在其中扮演极其重要的角色。由此，推测蛋白质之间的相互作用必定也介导或调节了血管生成素促血管新生的生物学过程，但目前对血管生成素相互作用蛋白质的了解较少。为了探索蛋白质相互作用在血管生成素功能活动中的作用，本实验室利用酵母双杂交技术，从人心肌cDNA文库和人肝脏cDNA文库中筛选得到21个与血管生成素可能具有相互作用的蛋白质，包括α辅肌动蛋白-2(ACTN2)、解整合素金属蛋白酶33(ADAM33)、Chordin(CHRD)、含表皮生长因子结构域的fibulin样胞外基质蛋白1(EFEMP1)、含表皮生长因子结构域的fibulin样胞外基质蛋白2(EFEMP2)、表皮生长因子样结构域7(EGF-like-domain，Multiple 7，EGFL7)、Fibulin-1(FBLN1)、Fibulin-2(FBLN2)、纤粘连蛋白(FN1)、颗粒蛋白(GRN)、α干扰素诱导蛋白27(IFI27)、层粘连蛋白β链(LAMB2)、潜活TGF-β结合蛋白3(LTBP-3)、潜活TGF-β结合蛋白4(LTBP-4)、人类枯草溶菌素转化酶6(PCSK6)、磷脂混杂酶1(PLSCR1)、肌纤维膜结合蛋白(SLMAP)、sprouty同源物1(SPRY1)、滑膜细胞凋亡抑制物1(SYVN1)和PXDNL。为了在这些可能的血管生成素相互作用蛋白质中确定与血管生成相关的重要蛋白质、探索它们之间的内在联系、建立可能的促进血管生成的生物学通路，本学位论文计划从酵母双杂交的结果出发，采用系统生物学的方法和手段，寻找包括血管生成素在内的22个蛋白质之间的可能联系，尝试构建血管生成素相互作用蛋白质网络，以期为下一步的实验研究提供指导性线索。 为此，利用DAVID系统和BiNGO系统，本研究首先调查了这22个蛋白质在结构上的相似性和功能上的相关性。从结构角度分析发现，这22个蛋白质中有10个蛋白质均包含一个表皮生长因子(EGF)结构域；而在这10个蛋白质中，有7个蛋白质均包含钙离子结合的表皮生长因子结构域(EGF-CA)，提示EGF结构域在这些蛋白质与血管生成素之间的相互作用过程中扮演重要作用。随后，对7个均含有EGF-CA的蛋白质片段进行多序列比对，发现存在一条非常保守的EGF-CA模序，命名为ANG-EGF-CA-Motif,深入研究该模序在血管生成素与蛋白质相互作用中的功能是有意义的。分析显示，酵母双杂交筛选得到的相互作用蛋白中有四个是Fibulin家族蛋白，且从cDNA文库中筛选获得的片段均为该家族高度保守的EGF-CA重复序列。据此，预测Fibulin家族的最后一个成员Fibulin-5可能与血管生成素也有相互作用，可以用实验验证。功能分析显示筛选到的蛋白质大部分属于胞外基质蛋白，少部分属于膜蛋白、胞内基质蛋白以及核蛋白，均参与细胞的增殖、分化、迁移等生物学过程；同时，这些蛋白质具有与蛋白质和金属离子，尤其是钙离子结合的能力。然后，为了构建血管生成素相互作用蛋白质网络，探索并挖掘血管新生相关的生物学信息，本学位论文利用当前丰富的蛋白质相互作用数据库，从BioGRID、MINT、HPRD和APID四个数据库以及两篇人类蛋白质相互作用组(Interactome)相关的文献中查找与这22个蛋白质有相互作用的其他蛋白质，扩大数据样本量，最终得到357对蛋白质相互作用数据。然后，用计算方法(PRINCESS)验证相互作用的可信度，得到41.46％的相互作用的似然比大于2.0，即为高可信度相互作用蛋白质，相比实验组(25.21％)可信度大大提高。在此基础上，利用Cytoscape软件构建了包括本实验室筛选得到的21对相互作用在内的总计377对相互作用数据的蛋白质网络。通过分析网络拓扑性质，发现实验组网络趋向于无尺度网络(scale-free network)，而控制组则趋向于随机网络(random network)。随后，为了深入分析蛋白质网络，本学位论文根据k>1的原则剔除实验组网络中除22个目标蛋白质以外的其他蛋白质，简化网络，构建了蛋白质相互作用子网络。子网络分析表明，FBIN2、FBLN1，FN1、EFEMP2、PLSCR1等蛋白质在网络中具有特别重要的作用，并且发现生长因子非依赖1B(GFI1B)和萎缩蛋白1(ATN1)两个新的蛋白质在网络中具有同样重要的作用，推测它们与ANG的相互作用可能与血管新生相关，值得进一步研究。 总之，本学位论文分析了酵母双杂交得到的血管生成素相互作用蛋白质并进一步构建了血管生成素相互作用蛋白质网络，为血管生成素相互作用蛋白质之间的关系探索以及血管生成素促血管生成作用机制的阐明提供了实验线索，有助于研究的扩展和深入。