第一章 父亲肥胖对子代代谢的影响:前瞻性队列研究研究目的:近40年来,肥胖的发病率在世界范围内显著升高。同时,肥胖带来的问题日益严重,心血管疾病,2型糖尿病和癌症严重危害着人类健康。但是,除了肥胖对个人健康的危害外,越来越多的证据表明亲代肥胖对子代健康也产生着显著不利影响。父亲肥胖对子代生长发育、胰岛素稳态等产生的不利影响在动物研究中已有明确报道,但相关人群研究较少,对不同性别子代的影响也有较大争议。本研究的目的是明确在人群中,父亲肥胖对幼儿期和青春期早期子代糖代谢和脂代谢稳态的影响,并探讨男女子代在不同后天营养条件下对父亲肥胖作用的敏感性。研究方法本研究是一项前瞻性队列研究。研究共纳入在2014年1月至2019年10月于山东大学附属生殖医院进行辅助生殖治疗后远期随访的1647次父亲/子代组合,其中父亲肥胖/超重组[体重指数(Body mass index,BMI)≥25kg/m2]子代随访696次,父亲正常体重组(BMI<25 kg/m2)子代随访951次。我们首先比较了在全部子代及不同性别子代中,父亲超重/肥胖子代与正常子代间糖代谢指标和脂代谢指标的差异。并进一步根据子代性别和热量摄入进行分层,探索父亲超重/肥胖组子代与正常子代在高热量摄入和低热量摄入状态下糖代谢指标和脂代谢指标的差异。糖代谢指标包括空腹血糖,空腹胰岛素,胰岛素抵抗稳态模型(Homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)和 β细胞敏感性稳态模型(Homeostasis model assessment of pancreatic beta cell function,HOMA-B);脂代谢指标包括甘油三酯,总胆固醇,低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇。符合正态分布的参数采用均数±标准差表示,不符合正态分布的参数采用中位数(第25位百分数,第75位百分数)表示。统计学方法采用混合效应模型,模型中不符合正态分布的参数采用自然对数转换。统计学软件采用 R3.6.1。结果:在全部子代中,超重/肥胖父亲子代空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR和甘油三酯显著高于正常子代[空腹血糖:5.09±0.39 vs.5.04±0.40,平均差异(Mean difference,MD):0.07,95%可信信区间(Confidence interval,CI):0.03-0.11;空腹胰岛素 5.72(3.61,8.34)vs 5.14(3.41,7.61),MD:0.13,95%CI:0.06-0.19);HOMA-IR:1.30(0.81,1.95)vs 1.17(0.73,1.76),MD:0.14,95%CI:0.07-0.21,甘油三酯:0.70(0.56,0.92)vs 0.68(0.55,0.86);MD:0.04,95%CI:0.01-0.08]。在女性子代中,空腹血糖、空腹胰岛素和HOMA-IR在父亲超重/肥胖组显著高于正常子代[主效应:空腹血糖:5.05±0.41 vs 4.99±0.39,MD:0.07,95%CI:0.01-0.13,空腹胰岛素:5.94(3.60,8.63)vs 5.16(3.53,7.48),MD:0.14,95%CI:0.05-0.23);HOMA-IR:1.33(0.79,2.00)vs 1.14(0.75,1.71),MD:0.15,95%CI:0.06-0.25]。但是,脂代谢指标在两组子代中没有统计学差异。按热量分层后,在高热量摄入状态下,肥胖父亲女性子代空腹血糖、空腹胰岛素,HOMA-IR 仍高于正常子代(空腹血糖:5.09±0.41 vs 4.99±0.40,MD:0.10,95%CI:0.02-0.18;空腹胰岛素:6.82(4.14,9.83)vs 5.57(3.61,7.69),MD:0.17,95%CI:0.05-0.29;HOMA-IR:1.58(0.84,2.35)vs 1.20(0.78,1.76),MD:0.19,95%CI:0.06-0.32);但是在低能量摄入状态下,女性子代糖代谢指标在超重/肥胖父亲子代与正常子代中没有统计学差异。在男性子代中,超重/肥胖父亲子代空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR和甘油三酯水平显著高于正常子代[主效应:空腹血糖5.14±0.36vs 5.10±0.40,MD:0.08,95%CI:0.02-0.13;空腹胰岛素 5.40(3.70,8.16)vs 5.14(3.37,7.73),MD:0.11,95%CI:0.02-0.20;HOMA-IR:1.25(0.82,1.86)vs 1.17(0.73,1.79),MD:0.12,95%CI:0.03-0.22;甘油三酯:0.69(0.55,0.92)vs 0.66(0.53,0.84),MD:0.06,95%CI:0.01-0.12]。但按热量摄入分层后,高热量摄入下超重/肥胖父亲男性子代仅空腹血糖水平显著高于正常男性子代(5.19±0.32 vs 5.13±0.43,MD:0.10,95%CI:0.02-0.18),空腹胰岛素、HOMA-IR和甘油三酯水平在两组间无差异;低热量摄入下,上述指标均无统计学差异。结论父亲肥胖可以损伤子代糖代谢和脂代谢稳态。在幼儿期和青春期早期,肥胖父亲的女性子代比男性子代更容易出现糖代谢异常,特别是在高热量摄入的环境中;而肥胖父亲男性子代则易出现高甘油三酯血症,潜在增加了他们远期代谢性疾病的风险。第二章父亲肥胖对子代外周血炎症表型的影响研究目的:目前,越来越多的研究者们认为肥胖是一种慢性的炎症状态。这种慢性的免疫系统失衡在肥胖与胰岛素抵抗中扮演了重要角色。目前已经有证据表明,亲代的免疫异常可以通过配子传递引起子代免疫系统的改变,进而导致相关疾病的发生。但至今,父亲肥胖对子代外周血炎症表型的影响还未有研究报道。因此,本研究的目的是探究在人群中父亲肥胖对子代外周血T细胞亚群以及相关炎症因子表达的影响。研究方法:本研究为巢式病例对照研究,共纳入2-7岁子代95例,其中超重/肥胖父亲(BMI>25kg/m2)子代48例,正常体重父亲(BMI<25kg/m2)子代47例。我们采集子代外周血并分离单个核细胞,应用流式细胞术用来检测CD4+CD25+CD127low 调节性 T 细胞(Regulatory T cells,Treg)、CD3+CD4+IFNγ+Th1 细胞、CD3+CD4+IL17+Th17 细胞和 CD3+CD4+IL22+Th22 细胞在不同组子代外周血中的表达。此外,我们应用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测了超重/肥胖父亲女性子代和正常女性子代血浆中瘦素、脂联素,炎症因子IL-6,IL-8,TNA-a和IL-1b和趋化因子CCL-5,MCP-1的表达情况。结果:在全部子代和女性子代亚组中,超重/肥胖父亲子代Treg细胞的比例显著低于正常子代(全部子代:3.32±2.22 vs 4.73±3.01,p=0.01;女性子代:3.06±1.85 vs 5.42±3.25,p<0.01),但是在男性子代中没有显著性差异。在全部子代中,促炎IFNγ+Th1细胞比例在超重/肥胖父亲子代和正常子代间没有统计学差异。但是,按性别分层后,在女性子代中,超重/肥胖父亲子代IFNγ+Th1细胞比例高于正常子代(7.97±5.69vs 5.12±3.19,p=0.09),且两组间的差距随年龄的增加而加大;IFNγ+Th1细胞比例在超重/肥胖父亲男性子代和正常男性子代中没有显著差异。Th17细胞和Th22细胞在全部子代及各性别亚组内均没有病例对照组间差异。EILSA结果显示,在女性子代中,父亲超重/巴胖组血浆中瘦素水平显著高于父亲正常体重组,但是脂联素及各炎症因子和趋化因子水平在超重/肥胖父亲子代和正常子代间未发现统计学差异。结论:父亲肥胖影响了女性子代幼儿期外周血中T细胞相关的免疫应答,主要表现为参与抗炎免疫反应的Treg细胞的减少,和参与促炎免疫反应的Th1细胞及它分泌的IFN-γ炎症因子的增加。肥胖父亲对男性子代幼儿期外周血T细胞表型没有明显影响。第三章父亲肥胖对子代脂肪组织免疫细胞表型及相关炎症的影响和机制研究研究目的:脂肪炎症在肥胖与胰岛素之间发挥着重要作用。脂肪组织的稳态主要由巨噬细胞调节。在接受应激信号时,巨噬细胞会释放特定功能相关的信号,吞噬死亡的脂肪细胞。但是,当刺激过大时,组织中留驻的巨噬细胞的能力不足,会从外周血中招募巨噬细胞共同维持脂肪组织稳态。研究证实在成人中,肥胖患者脂肪组织中巨噬细胞和T细胞数量增加,分泌相应的炎症因子,参与并促进了胰岛素抵抗的发生,但在儿童中是否有相似的病理生理变化还不清楚。在第二部分研究中,我们发现肥胖父亲的子代循环系统炎症因子增加,推测与其脂肪组织免疫细胞的改变相关,并参与了子代糖代谢异常的发生。因此,本部分研究旨在深入探讨父亲肥胖与子代成年早期脂肪组织免疫细胞表型的关系及相关炎症因子的改变,并初步探索这种改变与子代糖代谢异常的关系。研究方法:我们给雄性C57/BL6J小鼠高脂饮食(Western-type diet,WD)或正常饮食(Low-fat chow diet,CD)3个月后与正常饮食的雌鼠交配,建立肥胖父亲子代和正常体重父亲子代小鼠模型。产仔断奶后,给子代正常饮食或者高脂饮食,模拟基础状态和应激状态建立子代后天不同热量摄入组模型。根据其父亲肥胖和子代后天热量摄入的情况,一共分为4组:父亲肥胖/后天正常饮食组(Paternal obesity group,PO/CD),父亲正常体重/后天正常饮食组(Control group,Con/CD),父亲肥胖/后天高脂饮食组(PO/WD),父亲正常体重/后天高脂饮食组(Con/WD)。在子代7周龄时,应用葡萄糖耐量实验(Intraperitoneal injection glucose tolerance test,IPGTT)检测子代糖耐量水平。在子代8周龄时,我们取其性腺旁内脏脂肪(peri-gonadal adipose tissue,PAT)和腹股沟区皮下脂肪(subcutaneous adipose tissue,SAT),通过流式细胞术检测巨噬细胞和树突状细胞(macrophage and dendritic cells,Mφ/DCs)、T细胞等免疫细胞的变化和相关炎症因子的表达。结果:IPGTT结果提示在雌性子代中,PO/CD组在葡萄糖注射15、30分钟后血糖值显著高于Con/CD组;高脂饮食刺激下,PO/WD组葡萄糖注射15分钟后血糖仍显著高于Con/WD组。两组葡萄糖曲线下面积(Glucose area under the curve,GAUC)在正常饮食和高脂饮食状态下均无差异。而在雄性子代中,PO/CD组各时点血糖值和GAUC显著低于Con/CD组,但是PO/WD组GAUC与Con/WD相比并无统计学差异。免疫细胞检测结果显示:在雌性子代中,PO/CD组SAT中Mφ/DCs数量显著少于Con/CD组,且其变化趋势与正常子代在高脂饮食刺激后的变化一致(Con/WD vs.Con/CD);在高脂饮食刺激后,PO/WD组又进而发生PAT中Mφ/DCs数量的显著下降(PO/WD vs.PO/CD)。与雌性子代不同,PO/CD组雄性子代SAT中Mφ/DCs、T细胞数量显著高于Con/CD组,PAT中Mcφ/DCs数量则显著低于Con/CD组,且其变化趋势同样与正常子代在高脂饮食刺激后的变化一致(Con/WD vs.Con/CD);高脂饮食刺激后,PO/WD组SAT中Mφ/DCs数量较PO/CD组显著减少,但PAT中Mφ/DCs数量却有增加趋势。进一步对Mcφ/DCs进行亚群分类分析结果显示CD11c+CD206lowMcφ/DCs比例在PO/CD组显著高于Con/CD组,且在雌、雄子代的PAT和SAT中趋势相同。PO/CD组雌性子代的PAT和SAT中CD11c+CD206lowMφ/DCs分泌的促炎细胞因子IL-12显著高于Con/CD组。雄性子代的PAT和SAT中IL-12虽然也有升高趋势,但未达到统计学差异。在高脂饮食刺激下,PO/WD组雌性子代的PAT或SAT中的CD11c+CD2061owMφ/DCs比例与Con/WD组间不再有显著差异,但雄性子代PAT中CD11c+CD206lowMφ/DCs比例仍显著高于Con/WD组,SAT中则无明显差异。结论:父亲肥胖可以改变成年早期子代脂肪组织中免疫细胞表型,且CD11c+CD206low巨噬细胞是参与该年龄段炎症反应的主要巨噬细胞亚群。这种免疫细胞的变化刺激了促炎因子释放的增加,促进了脂肪炎症,参与了子代糖耐量异常的发生,该病理生理作用在雌性子代中更为明显。肥胖父亲雄性子代皮下脂肪中留驻巨噬细胞数量的增加在正常饮食状态下为其糖代谢稳态暂时提供了一定的保护作用,但是内脏脂肪组织的免疫失衡提示在高脂饮食应激下远期仍可能发生糖耐量异常。