两种重要甘薯病毒快速检测技术研究

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甘薯卷叶病毒(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV)和甘薯褪绿矮化病毒(>weet potato chlorotic stunt virus, SPCSV)是侵染我国甘薯的两种主要病毒,近年来在我国主要甘薯产区严重发生,给甘薯生产造成严重危害。建立快速、高效、实用的的病毒检测技术,加强对甘薯重要病毒的监测和预警,对于甘薯病毒病害的防控具有重要意义。本研究建立了PCR法制备地高辛标记探针检测甘薯卷叶病毒的核酸杂交法。利用非放射性标记物地高辛(DIG),通过PCR方法制备了甘薯卷叶病毒(SPLCV) CP基因的探针。通过对探针特异性、灵敏性、重复性和稳定性试验,建立了SPLCV斑点杂交检测方法。结果表明,该探针不与其它常见甘薯病毒发生反应,具有较强的特异性,最低可检测到0.9 ng/μl的病毒样品,具有较高的灵敏性,可用于甘薯田间样品SPLCV的检测。甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)可划分为东非(SPCSV-EA)和西非(SPCSV-WA)两个株系,近年的检测结果表明,我国甘薯上主要是SPCSV-WA。本研究根据GenBank中登录的SPCSV-WA CP基因序列,本研究利用逆转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP),设计4条引物,以感染SPCSV-WA甘薯叶片总RNA为模板,进行一步法RT-LAMP,在65℃条件下反应1h。扩增产物利用琼脂糖电泳分析和SYBR green I荧光染料显色判断结果,同时对扩增产物的电泳条带进行基因克隆和测序鉴定。利用常规RT-PCR和建立的RT-LAMP方法对14份甘薯样品进行SPCSV-WA检测,比较两种方法的检测结果。建立的LAMP方法可特异地对SPCSV-WA进行检测,且最低可检测出101数量级的模板。RT-LAMP产物的克隆测序表明,感染SPCSV-WA甘薯样品的RT-LAMP产物为SPCSV-WA CP基因序列。14份田间甘薯样品检测表明,RT-LAMP与RT-PCR方法检测结果完全一致。本研究建立了SPCSV-WA RT-LAMP可视化检测方法,为SPCSV-WA的检测提供了一个简便、可靠的方法。
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