研究背景膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁国民的生命健康。70-80%的患者初诊为非肌层浸润性膀胱癌,其复发率达50-70%,临床治疗多首选经尿道膀胱肿瘤切除术(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)。20-30%的患者初诊为肌层浸润性膀胱癌,其预后较差,患者的五年生存率仅为60%,临床多采用根治性膀胱切除或者放射性疗法等系统性治疗。因此,准确预测膀胱肿瘤是否发生肌层浸润对临床采取及时有效的治疗措施具有重要的指导意义。目前,经尿道肿瘤切除术后组织病理学检查是判断膀胱癌是否发生肌层浸润的主要方法,但此检查具有创伤性,患者的依从性较差,且其判定肿瘤是否发生肌层浸润的准确性有限。传统的尿液脱落细胞学检查预测肌层浸润性膀胱癌的敏感性和特异性较低,限制了其在无创性评估膀胱癌肌层浸润中的临床应用。此外,影像学检查如超声和计算机断层扫描(computed tomography,CT)等较难对膀胱肿瘤的分期进行准确判读。因此,寻找敏感性和特异性高的无创性肿瘤标志物用以肌层浸润性膀胱癌分期的术前预测仍是临床亟待解决的难题之一。MicroRNAs(miRNAs)是真核生物体内一类长约19-25个核苷酸的非编码RNA,在肿瘤的发生、发展和转移等过程中发挥精细的调节作用。MiRNAs表达具有较明显的组织特异性,且在同种肿瘤的不同分期阶段,miRNAs也可呈现特定的表达谱。研究表明,血清中存在丰富且稳定的游离miRNAs,提示其可作为肿瘤早期诊断、临床分期及预后判断的潜在生物标志物。课题组前期研究发现,血清 6-miRNA panel(miR-152,miR-148b-3p,miR-3187-3p,miR-15b-5p,miR-27a-3p和miR-30a-5p)对膀胱癌具有较高的诊断效能,为膀胱癌的早期无创性筛查提供了新的检测途径。鉴于此,本研究通过筛选肌层浸润性膀胱癌血清游离miRNAs表达谱,建立并评价血清4-miRNApanel在肌层浸润性膀胱癌临床分期中的应用价值。研究同时进一步探讨血清miRNAs对肌层浸润性膀胱癌预后的监测价值。最后,研究通过膀胱癌组织检测及系列细胞功能实验探讨miRNAs在膀胱癌发生及侵袭过程中的功能。本研究将建立基于血清游离miRNAs的膀胱癌分期预测和预后监测标志物,并探讨miRNAs作为肿瘤标志物在膀胱癌发生及进展中的生物学功能,为膀胱癌临床分期和预后评估标志物及治疗新靶点的发现提供参考依据。第一章基于血清游离microRNAs的肌层浸润性膀胱癌预测panel的建立目的检测肌层浸润性膀胱癌血清游离miRNAs表达谱,建立肌层浸润性膀胱血清游离miRNA预测panel,并分析血清游离miRNAs对肌层浸润性膀胱癌患者预后的监测价值。方法1.收集山东大学齐鲁医院207例肌层浸润性膀胱癌患者、285例非肌层浸润性膀胱癌患者和193例对照者血清。2.选取6例肌层浸润性膀胱癌患者、6例非肌层浸润性膀胱癌患者和6例对照者血清,通过miSeq高通量测序技术分别进行血清游离miRNAs表达谱检测,筛选三组间表达差异大于2倍的miRNAs作为候选分子,同时将课题组前期研究中发现的可用于膀胱癌诊断的6个miRNAs纳入候选分子进行验证。3.采用实时定量 PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR,RT-qPCR)在111例肌层浸润性膀胱癌患者、111例非肌层浸润性膀胱癌患者和187例对照者血清中验证候选miRNAs,确立肌层浸润性膀胱癌差异表达的miRNAs,采用多元logistic回归分析建立预测肌层浸润性膀胱癌的血清4-miRNApanel,通过受试者工作(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析血清 4-miRNApanel对肌层浸润性膀胱癌的预测效能。4.在90例肌层浸润性膀胱癌患者和168例非肌层浸润性膀胱癌患者血清中对4-miRNA panel的肌层浸润预测效能进行验证,并分析4-miRNA panel对不同病理分期膀胱癌的预测价值,同时与传统的尿液脱落细胞学及病理学分级进行对比。5.随访90例肌层浸润性膀胱癌患者的生存信息,采用Kaplan-Meier生存分析和Cox比例风险回归模型分析血清游离miRNAs对肌层浸润性膀胱癌预后的监测价值。结果1.通过miSeq高通量测序分析,在肌层浸润性膀胱癌患者组、非肌层浸润性膀胱癌患者组和对照组血清中分别检测到234、278和193个miRNAs(拷贝数≥10)。设定筛选标准为miRNAs表达拷贝数大于50且在三组之间差异均大于2倍,筛选出可作为肌层浸润性膀胱癌差异表达的23个候选miRNAs(miR-125b-5p,miR-130a-3p,miR-4732-3p,miR-3065-3p,miR-422a-3p,miR-378a-3p,miR-122-5p,miR-136-5p,miR-22-3p,miR-146a-5p,miR-205-5p,miR-769-5p,miR-19a-3p,miR-107,miR-320a,miR-423-5p,miR-486-3p,miR-574-3p,miR-4429,miR-25-5p,miR-103a-3p,miR-23a-3p 和 miR-362-5p)。同时纳入课题组前期研究中发现的可用于膀胱癌诊断的6个miRNAs(miR-152,miR-148b-3p,miR-3187-3p,miR-15b-5p,miR-27a-3p 和 miR-30a-5p)。因此,共筛选出29个候选miRNAs。2.将29个候选miRNAs在111例肌层浸润性膀胱癌患者、111例非肌层浸润性膀胱癌患者和187例对照者血清中进行RT-qPCR验证。结果显示,miR-422a-3p,miR-486-3p,miR-103a-3p 和 miR-27a-3p 在三组间呈现差异表达(p均<0.05)。ROC 曲线分析显示,miR-422a-3p,miR-486-3p,miR-103a-3p 和 miR-27a-3p 对肌层浸润性膀胱癌预测的曲线下面积(Area under ROC curve,AUC)分别为0.767(95%confidence interval[CI],0.706～0.821),0.718(95%CI,0.654～0.776),0.706(95%CI,0.641-0.765)和 0.641(95%CI,0.575-0.704)。3.基于多元logistic回归分析,构建血清4-miRNApanel:logit(p=肌层浸润性膀胱癌)=-1.5992 +(0.4938×miR-422a-3p)+(0.4197×miR-486-3p)+(0.4168×miR-103a-3p)+(0.2335×miR-27a-3p)。血清 4-miRNA panel 预测肌层浸润性膀胱癌的AUC为0.894(95%CI,0.846～0.931)。设定cut-off值0.0282作为临界值,血清4-miRNA panel预测肌层浸润性膀胱癌的灵敏度为90.99%,特异度为72.97%。4.采用0.0282作为临界值,在另一人群(90例肌层浸润性膀胱癌患者和168例非肌层浸润性膀胱癌患者)中分析4-miRNA panel对肌层浸润性膀胱的预测价值。结果显示,4-miRNA panel正确预测121例非肌层浸润性膀胱癌患者,特异度达70.06%(95%CI,79.1～90.1);正确预测79例肌层浸润性膀胱癌患者,灵敏度达 90.00%(95%CI,81.9～95.3)。ROC 曲线分析显示,4-miRNApanel 预测肌层浸润性膀胱癌的AUC为0.880(95%CI,0.834～0.917),明显高于肿瘤病理分级(AUC=0.779,95%CI,0.724～0.828)和传统的尿液脱落细胞学(AUC=0.602,95%CI,0.539～0.662)。4-miRNApanel 对 Ta期和 T1期膀胱癌预测特异度分别为61.82%和71.68%,对T2期、T3期和T4期膀胱癌预测灵敏度分别为 78.57%、87.18%和 95.65%。5.对90例肌层浸润性膀胱癌患者进行生存信息随访,中位随访日期为56个月(3-73 个月)。Kaplan-Meier 生存分析显示,低表达血清 miR-486-3p(p=0.002)和miR-103a-3p(p=0.034)的肌层浸润性膀胱癌患者五年生存率明显低于高表达患者。多变量Cox比例风险回归模型分析显示,血清miR-486-3p(p=0.042)、血清miR-103a-3p(p=0.021)、肿瘤病理分期(p=0.030)和淋巴结转移(p=0.025)可作为肌层浸润性膀胱癌患者的独立预后指标。结论血清游离 miR-422a-3p,miR-486-3p,miR-103a-3p 和 miR-27a-3p 可作为肌层浸润性膀胱癌预测的潜在肿瘤标志物,本研究构建的血清4-miRNApanel对膀胱癌分期预测具有较高的临床价值,明显优于尿液脱落细胞学及病理分级。此外,血清游离miR-486-3p和miR-103a-3p可作为肌层浸润性膀胱癌患者的预后监测指标。第二章MiR-27a-3p在膀胱癌组织中的表达及功能研究目的分析miRNAs在膀胱癌和癌旁正常对照组织中的表达情况,并通过体外调控miR-27a-3p在膀胱癌细胞系中的表达水平进行系列细胞功能试验,探究其在膀胱癌发生及发展过程中的生物学功能。方法1.选取在肌层浸润性膀胱癌患者血清中差异表达的miRNAs(miR-422a-3p,miR-486-3p,miR-103a-3p 和 miR-27a-3p),通过 RT-qPCR 检测其在 40 例肌层浸润性膀胱癌及40例非肌层浸润性膀胱癌组织中的表达。2.选取差异表达的miRNA(miR-27a-3p),检测其在40对肌层浸润性膀胱癌及癌旁对照组织中的表达,并分析膀胱癌组织中miR-27a-3p的表达水平与临床病理参数的关系。3.采用RT-qPCR检测miR-27a-3p在膀胱癌细胞(T24)及永生化正常上皮细胞(SV-HUC-1)中的表达水平。4.使用脂质体 LipofectamineTM2000 分别将 miR-27a-3p 模拟物(mimic)和miR-27a-3p拮抗物(inhibitor)转染至T24膀胱癌细胞中,同时设立miR-NC组和mock组作为对照组,采用RT-qPCR检测各组细胞的转染效率;5.通过CCK8细胞增殖实验、划痕实验及Transwell迁移和侵袭实验等分析转染miR-27a-3p mimic和inhibitor后T24膀胱癌细胞的增殖、迁移及侵袭活性的变化。结果1.miR-27a-3p在肌层浸润性膀胱癌组织中的表达显著低于非肌层浸润性膀胱癌组织(p<0.05),且miR-27a-3p的表达水平在70%的肌层浸润性膀胱癌患者组织中较配对癌旁对照组织显著降低(差异倍数大于2倍)。而miR-422a-3p,miR-486-3p和miR-103a-3p在肌层浸润性膀胱癌与非肌层级浸润性膀胱癌组织间的表达差异无统计学意义(p均>0.05)。2.miR-27a-3p在膀胱癌组织中的表达水平与肿瘤病理分期(p=0.03)和淋巴结转移(p=0.01)显著相关,与患者性别(p=0.33)、年龄(p=0.16)、肿瘤病理分级(p=0.92)和肿瘤病理分型(p=0.42)无显著相关性。3.RT-qPCR检测结果显示,miR-27a-3p在T24膀胱癌细胞中的相对表达量显著低于永生化正常上皮细胞(p<0.01)。4.与miR-NC组及mock组相比,T24膀胱癌细胞在转染miR-27a-3p mimic后48h,72h及96h三个时间段中生长速度明显减慢(p均<0.05)。而与miR-NC组及mock组相比,T24膀胱癌细胞在转染miR-27a-3pinhibitor后48h,72h及96h三个时间段中生长速度明显加快(p均<0.05)。5.划痕实验中,T24膀胱癌细胞miR-NC组、mock组和miR-27a-3pmimic组在转染 24h 后伤口愈合率分别为(35.27±2.01)%、(28.7±2.05)%、(15.57士1.06)%,miR-27a-3p mimic转染组膀胱癌细胞伤口愈合率明显低于miR-NC组和 mock组(p均<0.05)。T24 膀胱癌细胞 miR-NC 组、mock 组和 miR-27a-3p inhibitor 组在转染 24h 后伤口 愈合率分别为(24.57 ± 1.60)%、(17.63 ±2.91)%、(51.03±1.29)%,miR-27a-3p inhibitor转染组膀胱癌细胞伤口愈合率明显高于miR-NC 组和 mock 组(p均<0.05)。6.Transwell迁移实验中,T24膀胱癌细胞miR-27a-3p mimic组在转染24h后穿膜细胞数显著低于miR-NC组和mock组(p均<0.05)。T24膀胱癌细胞miR-27a-3p inhibitor组在转染24h后穿膜细胞数显著高于miR-NC组和mock组(p均<0.05)。7.Transwell侵袭实验中,T24膀胱癌细胞miR-27a-3p mimic组在转染24h后穿膜细胞数显著低于miR-NC组和mock组(p均<0.05)。T24膀胱癌细胞miR-27a-3p inhibitor组在转染24h后穿膜细胞数显著高于miR-NC组和mock组(p均<0.05)。结论与癌旁对照组织和非肌层浸润性膀胱癌相比,miR-27a-3p在肌层浸润性膀胱癌组织中的表达均显著下调,且低表达的miR-27a-3p可显著增强膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,提示miR-27a-3p在膀胱癌的发生及进展过程中具有重要的生物学功能。本研究将为明确miRNAs在膀胱癌发病中的作用和发现膀胱癌新治疗靶点奠定理论基础。研究背景胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。淋巴结转移是胃癌转移的主要途径,也是影响胃癌患者预后的最重要因素之一。术前预测胃癌淋巴结转移可有效辅助临床选择最佳肿瘤切除方式。目前,手术后组织病理活检是诊断胃癌淋巴结转移的“金标准”,但此方法为有创性检查,且难以准确获取淋巴结转移的数目和范围。影像学检查如超声内镜、计算机断层扫描(computed tomography,CT)、核磁共振成像和正电子发射体层摄影(positron emission tomography,PET)-CT等现多用于评估胃癌患者是否发生淋巴结转移。然而,超声内镜检查淋巴结转移的准确性仍较为有限。PET-CT虽可辨别淋巴结是否受到癌细胞侵犯,但不利于发现淋巴结微转移的患者。这些影像学检查技术的局限性使其难以成为确诊胃癌淋巴结转移的可靠方法。血清学传统肿瘤标志物如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、碳水化合物抗原 19-9(carbohydrate antigen 19-9,CA19-9)和碳水化合物抗原 72-4(carbohydrate antigen 72-4,CA72-4)等虽多用于胃癌的早期筛查和复发监测等,但其检测胃癌淋巴结转移的灵敏度仍较低。因此,寻找可用于胃癌患者淋巴结转移术前预测的无创性血清学生物标志物仍是学术界关注的焦点之一。MicroRNAs(miRNAs)作为真核生物体内广泛存在的非编码RNA,在肿瘤淋巴结转移过程中发挥着重要的调节作用。血清中游离miRNAs含量丰富,且血清游离miRNAs表达谱具有较为明显的组织特异性和阶段特异性。研究表明,差异表达的血清游离miRNAs可作为结直肠癌、胆管癌和宫颈癌等多种肿瘤淋巴结转移预测的潜在生物标志物。尽管目前已有研究提出miRNAs如miR-1207-5p,miR-146a和miR-148a等在胃癌淋巴结转移阳性患者血清中呈现差异表达的趋势,但血清游离miRNAs对胃癌淋巴结转移的预测效能和预后监测价值仍尚不明确。基于上述问题,本研究通过高通量miSeq测序技术和两阶段的实时定量PCR(Reverse transcription quantitative real-time PCR,RT-qPCR)技术系统检测胃癌淋巴结转移阳性患者血清中差异表达的游离miRNAs。基于多元logistic回归分析建立4-miRNA panel,并对4-miRNA panel预测胃癌淋巴结转移的效能进行验证。最后,研究进一步评估血清中差异表达的游离miRNAs对胃癌淋巴结转移阳性患者预后的监测价值。目的确立胃癌淋巴结转移阳性患者血清差异表达的游离miRNAs,构建可用于胃癌淋巴结转移预测的血清4-miRNApanel,并评估血清游离miRNAs对胃癌淋巴结转移阳性患者预后的监测价值。方法1.前期收集山东大学齐鲁医院普外科203例胃癌淋巴结转移阳性患者、203例胃癌淋巴结转移阴性患者和健康体检中心83例健康对照者的血清。2.在测序阶段,选取10例胃癌淋巴结转移阳性患者、10例胃癌淋巴结转移阴性患者和10例健康对照者血清,对三组血清分别进行高通量miSeq测序分析,筛选出三组间差异表达的候选miRNAs。3.在训练阶段,选取103例胃癌淋巴结转移阳性患者、103例胃癌淋巴结转移阴性患者和73例健康对照者血清,通过RT-qPCR验证候选miRNAs的表达,确立胃癌淋巴结转移阳性患者差异表达的miRNAs。4.基于差异表达的miRNAs,通过多元logistic回归分析,构建血清4-miRNA panel,并采用受试者工作(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析其对胃癌淋巴结转移的预测效能。5.在验证阶段,选取90例胃癌淋巴结转移阳性患者和90例胃癌淋巴结转移阴性患者,盲法验证血清4-miRNA panel对胃癌淋巴结转移的预测价值,同时分析4-miRNA panel对N1期、N2期和N3期胃癌的预测能力。6.选取验证阶段中的90例胃癌淋巴结转移阳性患者,跟踪随访其生存信息。采用Kaplan-Meier生存分析绘制患者生存曲线,通过单变量和多变量Cox比例风险回归模型综合评估影响胃癌淋巴结转移阳性患者预后的因素。结果1.通过miSeq测序,在胃癌淋巴结转移阳性患者组、胃癌淋巴结转移阴性患者组和健康对照组血清中分别检测到158个miRNAs,225个miRNAs和181个miRNAs。选取表达拷贝数大于20且在三组间表达差异大于2倍的miRNAs作为候选分子。由此,初步筛选出19个miRNAs。2.在训练阶段,RT-qPCR 检测结果显示,4 个 miRNAs(miR-501-3p,miR-143-3p,miR-451a和miR-146a)在三组间的表达差异具有统计学意义(p均<0.05)。4个miRNAs预测胃癌淋巴结转移的曲线下面积(Area under ROC curve,AUC)分别为 0.790(95%confidence interval[CI],0.728～0.844),0.774(95%CI,0.711-0.830),0.710(95%CI,0.642～0.771)和 0.675(95%CI,0.606～0.738)。3.在训练阶段,通过多元logistic回归模型建立基于差异表达miRNAs的胃癌淋巴结转移预测panel,logit(p=胃癌淋巴结转移阳性患者)=-1.2020 +(0.3963×miR-501-3p)+(0.3768×miR-143-3p)+(0.2494×miR-451a)+(0.2106×miR-146a)。ROC曲线分析显示,血清4-miRNA panel预测胃癌淋巴结转移的AUC为0.891(95%CI,0.840-0.930),灵敏度为75.73%,特异度为87.38%。设定cut-off值-0.2398作为预测胃癌淋巴结转移的临界值。4.以-0.2398作为临界值,验证人群中共有116名胃癌患者被预测为淋巴结转移阴性患者,64名胃癌患者被预测为淋巴结转移阳性患者。解除盲法后,发现79名胃癌淋巴结转移阴性患者被正确预测,特异度达87.78%,53名胃癌淋巴结转移阳性患者被正确预测,灵敏度达63.33%。4-miRNApanel预测胃癌淋巴结转移的 AUC 为 0.822(95%CI,0.758～0.875)。血清 4-miRNA panel 预测 N1期、N2期和 N3 期胃癌的 AUC 分别为 0.709(95%CI,0.619～0.788),0.860(95%CI,0.787～0.915)和 0.914(95%CI,0.846-0.958)。5.验证阶段中,Kaplan-Meier生存分析显示,低表达miR-451a和miR-146a的胃癌淋巴结转移阳性患者五年生存率均明显低于高表达患者(p均<0.05)。单变量 Cox 比例风险回归模型分析显示,miR-451a(p=0.001)、miR-146a(p=0.016)和肿瘤病理分期(p<0.001)与胃癌淋巴结转移阳性患者总体生存率相关。多变量Cox比例风险回归模型分析显示,miR-451a(p=0.028)和肿瘤病理分期(p=0.011)可作为胃癌淋巴结转移阳性患者的独立预后指标。结论1.本研究发现血清游离 miR-501-3p,miR-143-3p,miR-451a 和 miR-146a 可作为预测胃癌淋巴结转移的潜在生物标志物,研究建立的血清4-miRNApanel可有效鉴别胃癌淋巴结转移阳性患者和阴性患者,为胃癌淋巴结转移的术前预测提供新的检测途径。2.血清游离miR-451a可用于独立评估胃癌淋巴结转移阳性患者的预后,有望成为胃癌淋巴结转移阳性患者的新型预后标志物。