Liguzinediol (LZDO)是对伞形科藁本属植物川芎(LigusticumWallichii Franch)分离提纯出的酰胺类生物碱单体川芎嗪(Ligustrazine)的侧链对位甲基进行羟基化结构修饰产物,化学名为2,5-二羟甲基-3,6-二甲基吡嗉。前期研究表明,LZDO通过作用于心肌细胞内肌浆网蛋白SRCa2+-ATP酶(SERCA2a)对正常及模型动物心脏产生较强的正性肌力作用,可改善心肌收缩功能和舒张功能,安全性高且无心律失常等不良反应,目前尚未有基于该靶点的药物。此外,药代动力学研究显示其灌胃给药后半衰期为1.6h,清除率约为0.9L/h·kg,说明LZDO在大鼠体内的消除及生物转化速率相对较快。对于消除快的药物,如果临床上给药间隔时间太长,血药浓度太低,则会达不到治疗效果;而若频繁给药则会导致中毒,患者用药依从性也会降低。由于目前市场上的正性肌力药作用靶点均在细胞膜上,对细胞膜上离子通道的影响造成心律失常等不良反应的产生,而本项目LZDO直接进入细胞内发挥作用,避开了离子通道而无心律失常等不良反应。其作用靶点新颖,安全性高,无疑成为正性肌力药物研究中的一个新的突破。而药物的半衰期反映了药物在体内消除(排泄、生物转化及储存等)的速度,表示了药物在体内的时间与血药浓度间的关系,它是决定给药剂量、次数的主要依据。因此,我们认为有必要对其进行结构修饰,旨在延长半衰期,改善药动学参数,减少患者用药次数,提高患者用药依从性,以满足临床上不同的剂型需求和给药方式。此外,LZDO构效关系研究提示LZDO对心脏的正性肌力作用不是简单的取决于羟基取代的数量和基团的极性大小,而是与分子的整体空间结构和电子云分布有关,其对位羟基是正性肌力活性的关键基团。本文通过以LZDO为先导物,通过两种不同的思路设计LZDO衍生物并进行药效学评价及药代动力学研究,旨在延长先导物的半衰期、改善药代参数并尽可能保留其正性肌力活性,以满足今后临床上不同的给药方式和剂型需求。第一种思路是通过设计合成LZDO酯类前药,利用体内酯酶水解快速转变并缓慢释放为目标化合物LZDO,来延长LZDO的半衰期;另一种思路是根据前期构效关系研究结果,保留LZDO对位两个羟基,通过增加吡嗪环侧链羟基所连的碳原子数设计合成仲醇系列化合物,来加大空间位阻,延缓其代谢。结果发现LZDO酯类衍生物2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪在体内可转化为LZDO并延长LZDO在体内的半衰期,仲醇衍生物2,5-二-(1-羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪在体内的半衰期与LZDO相比延长。此外,两类化合物均具有较强的正性肌力作用,可作为心衰治疗药物研究开发的候选化合物。本文研究内容主要分为两大部分第一部分:LZDO酯类前药的设计合成、药代动力学研究及药效学评价一、LZDO前药的合成以川芎嗪为原料,通过H2O2氧化,酯化等反应,合成了 3个酯类化合物2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪、2,5-二异丁酰氧甲基-3,6-二甲基吡嗪、2,5-二苯甲酰氧甲基-3,6-二甲基吡嗪,结构均经紫外可见分光光度仪(UV)、傅立叶变换红外光谱仪(IR)、核磁共振(NMR)、电子轰击质谱(MS)确证。二、LZDO前药的药理活性筛选通过正常大鼠离体心脏Langendorff灌流法观察LZDO酯类化合物对正常大鼠离体心脏的药理作用。结果可知,2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪、2,5-二异丁酰氧甲基-3,6-二甲基吡嗪、2,5-二苯甲酰氧甲基-3,6-二甲基吡嗪均具有正性肌力作用,与LZDO相比,活性有所下降,酯类化合物活性强弱顺序:2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪> 2,5-二异丁酰氧甲基-3,6-二甲基吡嗪> 2,5-二苯甲酰氧甲基-3,6-二甲基吡嗪。三、LZDO前药的药代动力学研究1、LZDO酯类前药在肝微粒体酶及体外血浆中的研究2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪、2,5-二异丁酰氧甲基-3,6-二甲基吡嗪、2,5-二苯甲酰氧甲基-3,6-二甲基吡嗪均能在1-3h内快速转变为中间体,并由中间体缓释转化为目标化合物LZDO。2、LZDO前药在肝微粒酶及体外血浆中的转化过程研究根据LZDO前药化合物在肝微粒体酶及体外血浆中的代谢稳定性考察研究结果,采用HPLC-MS法定性鉴定了三个前药在转化为目标化合物的过程中出现的中间体结构,我们推测前药在肝微粒体和血浆中首先快速脱去一个酯基成为中间体,再由中间体缓慢脱去另一个酯基转变成目标化合物LZDO。3、大鼠血浆中2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪和LZDO的测定方法的建立及其药动学研究我们选择体外活性最强的化合物2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪为前药代表化合物进行药代动力学研究,建立大鼠血浆中2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪及其代谢产物LZDO检测的高效液相色谱方法,并进行药代动力学研究。2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪和LZDO的血药浓度分别在0.203～104 mg·L-1、0.196～100.4 mg·L-1范围内呈线性,提取回收率均>80%,日内、日间精密度RSD<10%,符合生物样品分析要求。灌胃给予2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪高中低三个剂量组后,3h内转化为LZDO,同时测得体内LZDO t1/2延长至4h、AUC基本不变、CL降至0.4 L·h-1·kg-1。四、LZDO前药在大鼠体内的组织分布研究建立了 2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪和目标化合物LZDO在大鼠体内分布中的HPLC测定方法,并测定了大鼠十一个脏器(心、肝、脾、肺、肾、胃、胰、脑、小肠、肌肉、脂肪)3个时间点(1h、4h、8h)中2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪和LZDO的含量,进行器官组织分布研究。结果显示大鼠在灌胃给予2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪20mg·kg-1后1h,原形药物在组织中的含量已低于检测限,而目标化合物LZDO则广泛分布到各个组织,以胰腺组织分布最多,其次为靶器官心脏。给药后4h药物在组织中浓度逐渐下降,8h后部分脏器组织则无法测得药物。由此可见,2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪在体内转化成LZDO后,LZDO作为小分子化合物,分布广泛,迅速,可到达靶器官心脏,发挥正性肌力作用。五、LZDO前药在大鼠体内的代谢产物研究本文采用HPLC-CS法分析鉴定灌胃给予2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪后粪便和尿液中的代谢产物。收集粪便和尿液使用HPLC-Triple Q TOF5600仪器检测分析。结果显示,灌胃给予2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪20 mg·kg-1,粪便和尿液中均可测得目标化合物LZDO而未测出2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪原形。结合体外血浆以及体内组织分布研究结果,我们推测组织和血浆中均存在水解2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪的酯酶,促使2,5-二乙酰氧基甲基-3,6-二甲基吡嗪向目标化合物LZDO转变,最后再由LZDO经过胃肠道和肾脏,通过粪便和尿液排出体外。综上所述,LZDO三个酯类衍生物体外正性肌力活性与LZDO相比均有所下降,LZDO前药在体内可快速转变为中间体,并由中间体逐步转变为目标化合物LZDO,类似于缓慢释放的作用,从而达到延长LZDO在体内的半衰期,改善其药代参数的目的,充分说明其具有很好的前药特性,可作为临床心衰治疗的候选药物。第二部分:LZDO仲醇衍生物的设计合成、药代动力学研究及药效学评价一、LZDO仲醇衍生物的合成以LZDO为原料,通过氧化成醛并与格式试剂反应,合成了 LZDO仲醇衍生物2,5-二-(1 -羟基乙基)-3,6-二甲基吡嗪和2,5-二-(1 -羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪,结构均经紫外可见分光光度仪(UV)、傅立叶变换红外光谱仪(IR)、核磁共振(NMR)、电子轰击质谱(MS)确证。二、LZDO仲醇衍生物的药理活性筛选通过正常大鼠离体心脏Langendorff灌流法观察LZDO仲醇衍生物对正常大鼠离体心脏的药理作用。结果可知,2,5-二-(1-羟基乙基)-3,6-二甲基吡嗪和2,5-二-(1-羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪均具有正性肌力作用,活性较LZDO相对减弱。我们推测可能是由于LZDO仲醇衍生物侧链空间位阻较大,造成羟基部分被包埋,正性肌力活性不能完全发挥,活性减弱。三、LZDO仲醇衍生物的药代动力学研究大鼠血浆中2,5-二-(1-羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪的测定方法的建立及其药动学研究建立大鼠血浆中2,5-二-(1 -羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪检测的高效液相色谱方法,并进行药代动力学研究。2,5-二-(1-羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪的血药浓度分别在0.28～73 mg·L-1范围内呈线性,提取回收率均>80%,日内、日间精密度RSD< 10%,符合生物样品分析要求。灌胃给予以及静脉注射2,5-二-(1 -羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪后,低剂量组t1/2分别为3.79、3.63h,中剂量组t1/2分别为3.64、3.47h,高剂量组t1/2分别为3.46、3.62h;低剂量组AUC分别为31、37mg·h·L-1,中剂量组AUC分别为66、74mg·h·L-1,高剂量组AUC分别为130、140mg·h·L-1,CL约为0.3 L·h-1·kg-1。生物利用度达90%。与LZDO相比,半衰期显著延长,同时AUC显著增加,说明药代参数得以改善,药物吸收增加。四、2,5-二-(1-羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪在大鼠体内的组织分布研究本文建立了 2,5-二-(1-羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪在大鼠体内分布中的HPLC测定方法,并测定了大鼠十一个脏器(心、肝、脾、肺、肾、胃、胰、脑、小肠、肌肉、脂肪)3个时间点(1h、4h、8h)中2,5-二-(1-羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪的含量,进行器官组织分布研究。结果显示大鼠在灌胃给予前药20 mg·kg-1后1 h,2,5-二-(1-羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪已分布到各个组织,以肌肉组织分布最多。给药后4h药物在组织中浓度逐渐下降,8 h后部分组织已无法测的药物浓度。由此可见,2,5-二-(1-羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪的组织分布特征与LZDO相似,说明作为小分子化合物,分布广泛,迅速,可到达靶器官心脏,与肌肉组织可能存在特异性结合位点。五、2,5-二-(1-羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪在大鼠粪便中的代谢产物研究本文采用HPLC-MS法分析鉴定2,5-二-(1-羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪灌胃给药后粪便和尿液中的代谢产物。收集粪便和尿液使用HPLC-Triple QTOF5600仪器检测分析。结果显示,灌胃给予2,5-二-(1-羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪20 mg·kg-1,粪便和尿液中均可测得2,5-二-(1-羟基丙基)-3,6-二甲基吡嗪。粪便中主要有Ⅰ相代谢产物M2、M3 (M0氧化产物),M4、M6 (M0甲酰化产物),M5 (M0甲基化产物)以及Ⅱ相代谢产物M1 (M0葡萄糖醛酸结合物)。综述所述,我们通过保留LZDO对位羟基,延长羟基所连碳原子数增加位阻,尽管其正性肌力活性有所减弱,但半衰期与AUC较LZDO显著增加,说明化合物体内吸收增加,药代参数得以改善,可作为临床心衰治疗的候选化合物。