草鱼（Ctenopharyngodon idella）又名鲩鱼,由中国农业出版社出版的2020年版《中国渔业统计年鉴》显示我国2019年草鱼的养殖总产量为553.3万吨,而全国淡水养殖总产量约为3013.7万吨,草鱼养殖总产量则占全国淡水养殖总产量18.4%左右,因此,草鱼是我国水产养殖生产实践中最重要的养殖对象之一。然而,随着草鱼养殖业的发展,病害频发,如草鱼老三病、草鱼出血病以及各种新发疾病等,严重困扰了草鱼养殖产业的健康可持续发展。因此解析草鱼免疫分子机制,寻求病害防控新方法成为了迫切需要解决的问题。研究已经在高等脊椎动物体内很清楚地发现了很多细胞因子均与机体免疫防御功能关系密切,白细胞介素（Interleukin,IL）及肿瘤坏死因子家族（Tumor necrosis factor,TNF）是这些细胞因子中的重要成员,在各种免疫反应中均扮演重要角色。据研究显示,白细胞介素具备参与调控机体的炎症反应及巨噬细胞的极化和迁移,增强吞噬细胞的吞噬活性,参与体液和细胞免疫应答,转变抗体类型,促进T淋巴细胞的成熟及分化等生物学功能。肿瘤坏死因子在机体免疫炎症,增殖分化和造血功能中发挥着多种作用。目前在脊椎动物中已经报道了多种白细胞介素可参与机体免疫防御,维护机体正常的功能运行,其中白细胞介素-22（Interleukin-22,IL-22）及IL-26均为重要的与炎症反应关系密切的细胞因子,但在草鱼中其具体的生物学功能尚未完全被解析。EDA基因参与皮肤上鳞片形成,而皮肤对于多种病原性生物具有强烈的抵抗作用,EDA是否也参与其中,是否也能调控机体炎症反应尚未见相关报道。1草鱼白细胞介素-22（IL-22）表达及功能鉴定白细胞介素（IL）-22在调节感染性病原体的炎症清除中起重要作用。在鱼类中发现了IL-22同系物,但其功能和IL-22的来源尚未完全阐明。本研究在草鱼中鉴定了一个IL-22同系物,并对其生物学活性进行了研究。草鱼IL-22在组织中呈组成性表达,在鳃和后肠中表达量最高。IL-22在感染柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌和草鱼呼肠孤病毒后的脾脏中,以及在LPS、IL-2、IL-21和IL-34刺激下的原代头肾和脾脏白细胞中,其表达均上调。相反,它被Th2细胞因子如IL-4/13B和IL-10下调。细菌产生的重组IL-22对原代头肾白细胞和CIK细胞炎性细胞因子、STAT3、SOCS3及抗菌肽的表达有促进作用。此外,用抗IL-22重组蛋白的单克隆抗体（GC3-22）在共聚焦显微镜下观察到IL-22阳性细胞在柱状黄杆菌感染后24h在后肠和头肾中被诱导。同时也发现IL-22炎症条件下可由CD4+T细胞分泌;经凋亡实验发现,IL-22可降低CCCP对CIK细胞诱导的凋亡率。研究也解析了草鱼IL-22蛋白结构,发现其具有典型IL-10家族细胞因子结构。我们的数据表明,IL-22在调节粘膜和系统免疫抵抗细菌和病毒感染方面起着重要作用。2草鱼白细胞介素-22受体1（IL-22RA1）表达分析IL-22的功能受体蛋白是一个复合物,由IL-22RA1和IL-10R2两个亚基组成,是IL-22唯一的膜上受体,其中IL-22RA1是IL-22特有受体,而IL-10R2是IL-10家族多数成员共用受体。高等脊椎动物IL-22通过IL-22RA1-IL-10R2蛋白二聚体向细胞内传递信号,而且这也是IL-22唯一传递信号的途径,在这哺乳动物中已经很明确。然而,目前关于低等脊椎动物如硬骨鱼类IL-22受体在病原微生物感染导致的炎症反应中的分子特征和作用的信息不多。根据基因染色体定位及基因同源性,从草鱼中鉴定了IL-22RA1同系物,预测发现其具有信号肽及跨膜区,是一种典型膜上蛋白结构。分析了草鱼IL-22RA1组织分布,显示其在后肠和鳃表达水平最高。在细菌、病毒等病原微生物刺激下,IL-22RA1表达水平显著上调;多种炎症细胞因子也可在不同细胞中诱导IL-22RA1表达;在原核表达系统中制备了His-rCiIL-22RA1重组膜外区域蛋白,可为进一步研究草鱼IL-22的生物学功能提供支撑。3草鱼白细胞介素-22胞外结合蛋白（IL-22BP）表达分析IL-22结合蛋白（IL-22 binding protein,IL-22BP）作为IL-22功能抑制性受体,其是一种天然的可溶性单链蛋白。哺乳动物中已经证实IL-22BP通过与IL-22功能受体蛋白复合物竞争,直接结合IL-22,阻止该细胞因子与细胞表面受体复合物相互作用,从而中和其生物活性。基于同源基因序列,通过本地BLAST在草鱼基因组CDS区数据库中找到了草鱼IL-22BP部分系列,从而设计引物克隆鉴定了草鱼IL-22BP。rCiIL-22BP序列含一段24 aa的信号肽,而又无跨膜区,因此其是一种典型的外分泌蛋白。经q PCR分析,结果显示IL-22BP在皮肤表达水平最高,在病原微生物感染初期均出现下调;抑炎细胞因子及LPS等可上调草鱼IL-22BP;制备了草鱼IL-22BP重组蛋白,同时也制备了单克隆抗体;研究也发现草鱼IL-22BP在炎症情况下可由CD4+T细胞分泌;解析了部分草鱼IL-22BP蛋白结构。研究可为进一步探究IL-22-IL-BP轴在硬骨鱼类炎症反应中的作用提供支撑。4草鱼IL-22与其受体互作研究IL-22及其受体（IL-22R及IL-22BP）互作在哺乳动物炎症反应中发挥着重要的作用。低等脊椎动物中特别是硬骨鱼类中,关于IL-22与其受体互作研究较少。本研究拟利用免疫沉淀、免疫荧光、q PCR及Western blot技术在细胞及蛋白水平研究IL-22与受体互作,并进一步探究IL-22生物学功能。基于以上研究作为基础,利用免疫沉淀反应,在体外证明了草鱼IL-22RA1及IL-22BP是IL-22的受体;经q PCR分析,研究发现了IL-22BP可在体外抑制IL-22蛋白的生物活性;经Western blot检测,证实草鱼IL-22可通过IL-22RA1-10R2复合受体激活STAT3磷酸化,从而介导生物学功能;经免疫荧光技术发现,草鱼IL-22及IL-22BP在炎症条件下可共同由CD4+T细胞分泌。研究进一步明确了在硬骨鱼类中IL-22通过与受体互作介导炎症反应。5草鱼白细胞介素-26（IL-26）表达及功能鉴定IL-26是IL-10家族中的重要成员,是一种促炎症细胞因子,目前已在人类、两栖动物和硬骨鱼类中被鉴定,但在啮齿类动物中未发现。虽然IL-26在草鱼等硬骨鱼类中被鉴定出来,并进行了炎症相关功能研究,然而,IL-26在包括硬骨鱼类在内的低等脊椎动物炎症调节中的作用尚不十分明确。经q PCR分析,发现草鱼IL-26在皮肤及头肾中表达最高;病原微生物尤其是细菌刺激草鱼可明显上调IL-26表达;LPS、PHA及促炎细胞因子均可在不同细胞诱导IL-26表达;草鱼IL-26可上调炎症细胞因子、STAT3及一些抗菌肽。本研究还制备了草鱼IL-26原核重组蛋白,并制备了IL-26单克隆抗体;筛选了草鱼IL-26蛋白晶体生长条件;研究也发现草鱼IL-26具备一定的诱导细胞凋亡的生物学功能。本研究进一步丰富了硬骨鱼类IL-26的理论知识。6草鱼外胚叶发育不全蛋白基因（Ectodysplasin-A,EDA）及其受体克隆与表达分析EDA是膜上蛋白,隶属于TNF家族成员,其受体为EDAR。EDA及其受体EDAR一直被认为仅与动物毛发、牙齿及骨骼生长发育有关。最近在鱼类中发现了EDA及其受体EDAR同系物,开展了其与鱼类鳞片生长的关系及进化方面的研究。本研究基于基因同源性,克隆鉴定了草鱼EDA及EDAR基因全长,并进行了相关生物信息学分析,预测了其蛋白结构,发现草鱼EDA蛋白是一种典型的无信号肽和跨膜结构域的非分泌型蛋白,而EDAR是一种典型的有跨膜结构域和信号肽的膜蛋白;经q PCR检测发现,EDA在草鱼皮肤表达水平较高,而EDAR则在脾脏表达较高;病原微生物尤其是细菌能明显诱导草鱼EDA及EDAR表达,特别是在皮肤上;LPS、PHA及炎性细胞因子均在不同细胞上调EDA及EDAR的表达。本研究暗示EDA及其受体EDAR参与了硬骨鱼类炎症反应,但有待于进一步深入研究。