紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上种植面积较大的多年生豆科牧草，具有草质优良、蛋白含量高、适应性强、适口性好、易于家畜消化等特点，享有“牧草之王”的美誉。盐碱胁迫限制了植物对水分和养分的吸收，严重影响了紫花苜蓿的产量和品质。为了揭示紫花苜蓿响应盐碱胁迫的分子调控机制，获得抗盐碱关键基因，本研究利用高通量测序技术对混合盐碱胁迫处理的紫花苜蓿进行转录组测序分析，筛选获得特异响应盐碱胁迫的候选基因，进一步对MsNAC47基因的功能进行了验证。主要研究结果如下：
　　1.紫花苜蓿抗盐碱转录组测序分析
　　对100mM混合盐碱(Na2CO3∶NaHCO3=1∶2)处理的肇东苜蓿进行转录组测序。共获得盐碱胁迫差异表达基因4,137个，在盐碱胁迫1d和7d中分别存在2,286和2,233个DEG。其中，1d处理组中发现了1,561个上调的DEG，725个下调的DEG；在7d处理组中发现了1,599个上调DEG和634个下调DEG。GO聚类和基因注释结果表明，差异基因在14个代谢途径中富集。109(1 d)和96(7 d)个差异表达基因被注释为转录因子，包括AP2，WRKY，MYB和NAC等基因家族。在盐碱胁迫下，紫花苜蓿中活性氧清除相关基因受到明显的诱导，类黄酮生物合成和修饰途径的关键酶基因表达水平显著上调，离子转运体，铁蛋白，有机酸合成代谢关键基因受到盐碱胁迫的诱导表达上调，钙离子信号通路相关基因仅在1d胁迫时受到诱导，另一方面，蔗糖和淀粉等多糖的合成和光通路相关基因的表达在盐碱胁迫条件下受到抑制。
　　对紫花苜蓿响应盐和盐碱胁迫的转录组数据进行了比较分析，筛选得到了8个差异基因，涉及碳同化，有机酸合成等代谢通路。在这些基因中，MsNAC47基因在盐胁迫下下调1.7倍，在盐碱胁迫下上调4.6倍，该基因在盐和盐碱胁迫下可能具有不同的功能。
　　2.盐碱胁迫响应基因MsNAC47的功能验证
　　利用RT-PCR克隆了紫花苜蓿MsNAC47基因，基因CDS全长1,023bp，编码由340个氨基酸残基构成的38.4kDa的蛋白，含有NAC家族特有的NAM结构域。MsNAC47基因与拟南芥中AtNAC47基因同源，与蒺藜苜蓿中同源基因MtNAC47具有94%的相似性。MsNAC47基因在紫花苜蓿根，茎，叶和花中均有表达，在花中的表达量最高。盐、盐碱、干旱及外源ABA等处理均可以诱导MsNAC47基因的表达，其中，盐和盐碱胁迫下，该基因在紫花苜蓿根中表现出不同的表达模式。
　　将MsNAC47对拟南芥突变体nac47进行了遗传转化，获得恢复突变体。平板根长实验结果表明，拟南芥突变体nac47植株在盐碱胁迫下根长显著短于野生型拟南芥Col-0，而在盐胁迫下nac47突变体的根长则长于Col-0，表现出了较低的盐碱抗性和较高的盐抗性。在对3周龄拟南芥幼苗的研究中发现，nac47突变体在60mMNaHCO3处理7天时表现出萎蔫和叶片黄化的胁迫现象，并伴随着显著的MDA积累和叶绿素的降解；而野生型拟南芥Col-0和过表达MsNAC47基因的拟南芥恢复突变体则在盐碱胁迫处理下没有出现明显的胁迫表型。这个结果表明，MsNAC47基因在恢复突变体中的过表达恢复了突变体植株对盐碱胁迫的抗性。
　　离子含量测定结果表明，nac47突变体的Na+/K+相比于Col-0在盐碱胁迫下更高，在盐胁迫下则较低；而钙离子的积累量则在两种胁迫下均显著低于野生型拟南芥。在盐和盐碱胁迫下对钙离子积累能力较强的植株通常表现出更强的抗性，NAC47基因的缺失可能影响了突变体植株的钙离子转运能力并因此造成了植物对不同胁迫的抗性差异。
　　3.MsNAC47调控钙离子依赖的盐碱响应途径
　　为了分析NAC47基因的缺失对植株钙离子积累过程的影响，进一步进行了盐碱胁迫下的离子流速和成像实验。拟南芥NAC47基因的缺失导致了胁迫响应的钙信号特征的改变，同时降低了钠离子转运的效率。钙离子成像实验发现，突变体相对于野生型具有较弱的钙信号强度和更短的静息钙浓度恢复时间。这些结果表明，NAC47基因参与对钙离子转运和钙信号途径的调控。
　　结合转录组和对突变体中钙离子转运体和钠离子转运体的表达分析发现，在盐碱胁迫下紫花苜蓿中MsNCL1，MsCAX3和NHX7基因呈现出与MsNAC47基因的共表达模式。参考紫花苜蓿基因组，对共表达的NCL，CAX和NHX家族基因进行了启动子区分析获得了上游启动子区中的潜在NAC47转录因子识别位点。通过酵母单杂交实验验证了MsNCL1和MsCAX3的表达受到MsNAC47基因的调控。MsNAC47可能在盐碱胁迫下通过调控MsNCL1和MsCAX3介导的钙离子转运通路在盐碱胁迫下对钙离子的转运进行调节，进而在植物响应盐碱胁迫的过程中发挥作用。