水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc）是水稻黄单胞菌(X.oryzae)种下的两个致病变种之一，引起水稻产生细菌性条斑病(简称条斑病)(BacterialLeaf Streak，BLS)，是水稻上的重要细菌病害。同其他革兰氏阴性植物病原细菌一样，X.oryzae pv.oryzicola拥有保守的hrp基因簇，决定着病原菌在非寄主植物和抗病寄主上的过敏反应(hypersensitive response，HR)和在感病寄主上致病性（pathogenicity）。hrp基因簇编码形成Ⅲ型分泌系统（TypeⅢ Secretion System，T3SS），在与植物互作时，X.oryzae pv.oryzicola将各种T3SS效应蛋白注入植物细胞中从而导致非寄主产生HR和在寄主水稻上产生BLS症状。　　 已有研究结果揭示，与同其它植物病原黄单胞菌一样，X.oryzae pv.oryzicola中调控T3SS和T3SS效应蛋白的关键调控因子是HrpG和HrpX。为此，本实验室前期研究中将X.oryzae pv.oryzicola野生型菌株RS105、hrpX基因突变体R△hrpX和hrpG基因突变体R△hrpG经与水稻悬浮细胞诱导后，通过基因芯片途径获得了一批可能受HrpG和HrpX调控的候选因子（资料未发表）。　　 目前X.oryzae pv.oryzicola中唯一已知的harpin蛋白是由hrp基因簇中的hpa1基因编码的。本文所在实验室的工作积累提示，X.oryzae pv.oryzicola中存在2个以上harpin类蛋白的编码基因。为了发掘除hpa1以外新的harpin类蛋白编码基因，本文基于harpin蛋白富含甘氨酸、不合半胱氨酸的特点以及受HrpG和HrpX调控的特征，从基因芯片数据中筛选出3个候选的harpin类蛋白编码基因hlpA、hlpB和hlpC（harpin-like proten）。为了快速检测3个候选基因是否能在非寄主烟草上激发HR，本研究从RS105菌株中克隆了这3个基因并构建至PVX病毒载体上，通过农杆菌介导在烟草上的瞬时表达，获得了可激发烟草产生HR的能力的hlpB基因。　　 为了了解HlpB蛋白的harpin蛋白特性，本研究通过大肠杆菌原核表达系统对hlpB进行了表达和纯化。结果显示，纯化后的HlpB蛋白表现出了harpin蛋白的共同特征:热稳定，对蛋白酶K敏感，能激发烟草产生HR。梯度浓度实验显示，HlpB激发烟草产生HR的最小浓度为50μg/ml，高于Hpa1的1μg/ml的浓度，并且在产生HR的烟草叶肉细胞发生明显的基因组DNA片段化，表明HlpB和Hpa1蛋白一样诱导烟草产生的HR有着与细胞编程死亡(PCD)同样的发生机制。　　 HR一直被认为是植物对病原物的一种抗性反应。HlpB蛋白注射烟草8h后显微镜观察结果显示，HlpB能诱导烟草中活性氧迸发和胼胝质的积累。进一步的Northernblot显示HlpB诱导烟草产生HR时能激活HR标志基因HIN1和HSR203J的表达，同时也能激活病程相关蛋白PR1-a的表达，同时与非寄主抗性相关联的BAK1、SGT1和MAP3K基因的表达也被显著的激活。这说明，HlpB能激活植物的基础防卫反应。这与已知的Hpa1相一致，所不同的是Hpa1能激活PR1-b的表达而HlpB则不能，暗示HlpB和Hpa1在激活植物防卫反应过程中所涉及的信号通路不完全相同。本研究的研究结果还显示，HlpB注射NahG烟草时不能激发HR产生，表明HlpB激发植物的防卫反应依赖植物SA信号积累和传导。另外，HlpB的HR激发能力受真核生物代谢抑制剂（LaCl3，Actinomycin D和Cycloheximide）的抑制。以上结果表明，HlpB是X.oryzaepv.oryzicola中Hpa1之外的新harpin蛋白。　　 为了研究hlpB基因在X.oryzae pv.oryzicola中的转录表达特性，本研究将hlpB启动子与报道基因gusA基因融合，导入野生型RS105在hrp诱导培养基XOM3和丰富培养基NB中进行GUS活性测定。结果显示，hlpB启动子可以驱动gusA基因在XOM3中表达，而不能在NB中有效表达，表明hlpB是受诱导表达的Real-time PCR检测结果也说明了这一点。　　 序列分析发现hlpB基因启动子区域含有一个不完整的PIP-box(TTCGG-N19-TTCGT)，为了揭示HrpG和HrpX对hlpB基因的调控机制，本研究将hlpB启动子中的PIP-box进行点突变(AACGG-N19-TTCGT)，与gusA基因融合后，分别导入野生型RS105、R△hrpG和R△hrpX中，进行GUS活性测定。结果显示，PIP-box突变后hlpB的表达不再依赖HrpG和HrpX调控，这说明hlpB基因的转录表达受HrpG和HrpX的调控。　　 为了明确HlpB蛋白在X.oryzae pv.oryzicola中是否依赖T3SS进行分泌，本研究将纯化的HlpB蛋白制备成多克隆抗体，在野生型RS105、T3SS突变体R△hrcC和R△hrcV、 T3SS效应蛋白出口控制突变体R△hpaB和R△hpaP中通过蛋白免疫杂交对其外泌蛋白进行检测，发现HlpB依赖完整的T3SS分泌到胞外，但不依赖HpaB和HpaP，这与已报道的Hpa1蛋白相一致。　　 植物病原细菌中的harpin类都有促进植物生长的功能。为了揭示HlpB对植物是否有促生作用，本研究通过HlpB纯化蛋白处理烟草和拟南芥的种子，发现，在2周内烟草和拟南芥的根系生长长度要明显长于清水对照的处理，并且平均每株幼苗鲜重是清水对照处理的2倍。这与之前在水稻条斑病菌中发现的Hpa1有着相同的促进植物生长的能力。另外，HlpB诱导烟草还能产生SAR。经HlpB处理的烟草与PBS蛋白溶液对照处理相比，烟草赤星病发病情况显著下降，具体表现为病斑变小，几乎不扩展。与Hpa1处理的烟草相比，赤星病发病情况无显著差异。因此HlpB与其它harpin一样，能激发植物SAR，显著提高植物抗病性。　　 为了明确hlpB是否参与了X.oryzae pv.oryzicola在水稻上的毒性，本研究对已知harpin蛋白基因进行了突变，获得了hlpB基因的缺失突变体R△hlpB及hpa1和hlpB双突变体R△hpa1△hlpB突变体。通过苗期水稻注射接种和成株期水稻针刺接种发现，hlpB的单突变体不影响X.oryzae pv.oryzicola在水稻上的致病性，但毒性较野生型有所下降。功能互补后突变体的毒性能恢复野生型水平。这表明，hlpB对X.oryzae pv.oryzicola的全毒性有贡献。有意思的是，R△hpa1△hlpB双突变体仍能激发非寄主烟草产生HR，这提示X.oryzae pv.oryzicola中还存在其他HR激发因子。　　 通过同源信息比对发现，hlpB广泛存在于革兰氏阴性病原细菌中，如E.coli、Pseudomonas、Xanthomonas、Ewinia、Ralstonia等，其中在植物病原Xanthomonas菌中高度保守（同源性达到90％以上）。为了明确这些同源蛋白是否也具有HR激发活性，本研究将相应的同源基因在大肠杆菌表达系统分别进行表达和纯化，然后注射烟草检测HR产生能力。结果发现，仅有来自Xanthomonas属中的HlpB蛋白能激发烟草产生HR，说明HlpB是Xanthomonas属中保守的HR激发蛋白。同时为了说明植物病原黄单胞菌HlpB蛋白的诱导表达特性，本研究利用Real-time PCR技术对hlpB同源基因的表达情况进行了检测，结果显示，这些hlpB同源基因均是依赖诱导条件下进行表达的。　　 鉴于X.oryzae pv.oryzicola的hpa1基因编码产物具有在非寄主烟草上激发HR的能力，体外施用时能诱导植物产生多种有益表型，如抗病、抗虫及促生等，但Hpa1并没有直接的杀菌活性。为了赋予Hpa1既具有HR诱导能力，又具有杀菌活性，本研究依据生物组合药物学设计，通过基因工程途径，获得了具有上述功能的融合蛋白Hcm1。为此，本研究将(H)pa1和抗菌肽(C)ecropin A(CA)的活性α螺旋以及蜂毒素(M)elittin(ME)的活性功能域巧妙的通过polylinker以及自由环进行连接，融合构建获得具有上述双重功能的融合基因hcm1。　　 本研究通过大肠杆菌表达系统和膜蛋白提取途径，获得了纯化的Hcm1蛋白。Hcm1保留了Hpa1在烟草上激发HR的能力，且能激活HR标志基因HIN1和HSR203J基因以及防卫反应基因（PR1-a）的转录表达。抑菌活性能力测定发现，Hcm1有较好的广谱抗菌性，对多数革兰氏阴性病原细菌(E.coli BL21(DE3)、R.solanacearumZJ3721、X.oryzae pv.oryzicola RS105和P.syringae pv.tomato DC3000）的生长有很强的抑制能力，对革兰氏阳性细菌（B.subtilis B168）和病原真菌（A.alternate TBA28、T.cucumeris JS01、M.oryzae Guy11和F.graminearum ZF21）也有抑制生长作用。最小抑制浓度(MIC)和致死中浓度(ED50)测定结果显示，Hcm1蛋白对植物病原细菌R.solanacearum ZJ3721，X.oryzae pv.oryzicola RS105和P.syringae pv.tomatoDC3000的MIC和ED50分别是1.0-1.25μM和0.75μM、1.0-1.25μM和0.5-0.75μM、1.0μM和0.25-0.5μM，对病原真菌A.alternate TBA28、T.cucumeris JS01、M.oryzaeGuy11和F.graminearum ZF21的MIC和ED50分别是6.0-7.5μM和4.0-5.0μM、3.5μM和2.0-2.5μM、2.5-3.0μM和1.25-1.5μM、3.5-4.0μM和2.5μM。Hcm1同Hpa1和cecropin A-melittin一样对蛋白酶K敏感。　　 为了说明Hcm1的防病作用，本研究选择烟草TMV病毒病、稻瘟病和番茄细菌性枯萎病作为检测对象。在烟草、水稻和番茄上间隔3天施应1.5μM浓度Hcm1两次后，在接种TMV、稻瘟病菌和茄科青枯雷尔氏病菌后，发现，Hcm1防治TMV的效果为46.4％，而Hpa1的效果为35.7％; Hcm1防治稻瘟病的效果为47.3％，而Hpa1的效果仅为5.5％; Hcm1防治番茄青枯病的效果为38.9％，而Hpa1的效果仅为7.4％。这表明，Hcm1可以用于植物病害的防治而且效果好于harpin蛋白Hpa1，主要是cecropin A-melittin构建于C-端Hpa1的结果。在防治植物病害机理上，本文推测Hcm1保留了Hpa1通过SA途径诱导植物产生了SAR，而抗菌肽等可能因SA的积累而增强了活性。这种假说与BHT提高杀菌剂活性的模式较为吻合。但不管怎样，利用HR激活因子Hpa1与抗菌肽进行组合药物学设计，还未见报道，并且这种双重功能的融合基因为转基因抗病植物品种的培育提供了基因资源。　　 水稻黄单胞菌属的hrp基因通过形成Ⅲ型分泌系统(T3SS)将致病性的效应蛋白注入植物细胞中从而决定在非寄主植物上的过敏反应和在寄主植物上的致病性。水稻白叶枯病菌X.oryzae pv.oryzae PXO99A的hpa2基因位于hrp基因簇最左端，启动子区域存在imperfect PIP-box，其基因产物属lytic transglycosylase家族，推测其可能溶解植物细胞壁从而使T3SS发挥作用。HrpF位于hrp基因簇的右端，在寄主细胞膜上形成转位装置将效应蛋白转运至寄主细胞中。　　 尽管X.oryzae pv.oryzae PXO99A中hpa2和hrpF已经进行单个基因的功能研究，但是Hpa2和HrpF是否存在互作关系，两者是否影响T3S效应蛋白的分泌或转运尚不清楚。本研究显示hpa2和hrpF基因分别突变后，降低了在水稻上的毒性，细菌生长能力减弱，但不影响在非寄主烟草上的HR，但是hpa2和hrpF同时突变后，X.oryzaepv.oryzae PXO99A在水稻上丧失了致病性，但在非寄主上仍有HR激发能力。　　 本研究中通过酵母双杂交(Y2H)发现X.oryzae pv.oryzae PXO99A中Hpa2和HrpF能够互作。蛋白质免疫杂交结果显示，Hpa2通过T3SS进行分泌，不影响T3S效应分子AvrXa10的分泌，但阻止AvrXa10通过T3SS转运进入植物细胞，推测Hpa2和HrpF互作形成复合体，控制效应分子转位进入植物细胞内，从而影响病原菌的致病性。