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目的：①对INSR基因的突变进行体外克隆及表达，以观察突变对于INSR表达水平的影响，并探讨突变影响INSR表达的可能机制。②通过评价INSR基因R83Q、A1028V突变对自身磷酸化能力的改变，以及对下游主要信号途径中关键底物磷酸化激活的影响，探讨其在RMS患者体内引发胰岛素抵抗的可能机制。③通过检测该例RMS患者体内脂联素水平，探讨在INSR功能缺陷造成的特殊胰岛素抵抗状态下脂联素的变化，并通过研究RMS患者在高胰岛素-正糖钳夹状态下，高胰岛素刺激对脂联素水平的改变，探讨脂联素与INSR功能缺陷引发的严重胰岛素抵抗之间的关系。
方法：⑴根据发现的INSR基因R83Q和A1028V突变，在体外应用诱导定点突变的方法进行INSR基因突变的体外克隆，构建携带突变的INSR基因表达质粒，并将质粒瞬时转染CHO细胞，应用RT-PCR、免疫印迹的方法检测转染细胞内不同突变INSR的表达水平。⑵应用免疫印迹的方法检测基线状态及给予胰岛素刺激后突变INSR自身磷酸化水平的改变；以及下游底物IRS-1、Akt、Erk1/2磷酸化水平的改变。⑶对RMS患者及其母亲进行高胰岛素.正糖钳夹试验，分别在钳夹开始前的基础状态及高胰岛素水平的稳态期进行血清脂联素水平的测定。同时取10例上海地区正常糖耐量女性为对照，正常体重组(NW)(BMI<25kg/m2)5例、超重/肥胖组(OW/OB)(BMI>25kg/m2)5例。
结果：①成功构建了具有突变位点的INSR基因表达质粒：pSRα-INSR-R83Q、pSRα-INSR-A1028V以及pSRα-INSR-R83Q/A1028V，并经直接测序证实。②体外研究结果显示，A1028V以及R83Q/A1028V突变INSR的自身磷酸化水平明显降低，与突变所导致的受体表达降低程度相对应；下游底物磷酸化结果显示，基线状态A1028V以及R83Q/A1028V突变受体磷酸化下游底物的水平与野生型均没有差别(P>0.05)，胰岛素刺激后A1028V、R83Q/A1028V突变受体磷酸化下游底物的水平较野生型明显降低。③NW组钳夹稳态期高胰岛素状态下脂联素水平较基础状态显著降低(基础状态40.40±10.93mg/L vs稳态期36.47±11.06mg/L，P<0.05)，但OW/OB组钳夹稳态期脂联素水平较基础状态无明显改变(基础状态25.72±4.04mg/L vs稳态期24.20±1.90mg/L，P>0.05)；钳夹前后RMS患者体内脂联素水平分别为：基础状态57.08mg/L，稳态期62.06 mg/L，提示其不受钳夹稳态期高胰岛素水平的抑制。其母亲钳夹基线状态的脂联素水平为41.9mg/L，稳态期的脂联素水平则有所降低为36.12mg/L。
结论：⑴成功进行RMS患者突变INSR基因(R83Q与A1028V)的体外克隆。INSR基因的A1028V突变主要通过影响INSR前体的加工，而导致其成熟受体表达的减少。而R83Q突变并不明显影响INSR的正常表达。⑵A1028V突变受体的自身磷酸化水平降低程度与表达降低程度一致，并且A1028V突变会导致INSR下游底物信号传导不同程度的障碍。R830突变不影响INSR的自身磷酸化以及下游底物的信号传导。因此INSR基因A1028V突变所导致的成熟INSR数目减少，引发胰岛素信号传递障碍，可能是造成RMS患者体内严重胰岛素抵抗的主要原因。⑶RMS患者虽然存在严重的胰岛素抵抗，但其体内脂联素水平却无明显降低，且不受钳夹时的高胰岛素水平抑制。INSR功能缺陷所导致的高胰岛素水平抑制脂联素产生的作用消失，可能是RMS患者体内脂联素水平增高的原因。