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研究背景和目的:几乎所有的EGFR突变非小细胞肺癌患者在使用EGFR-TKIs治疗后最终会出现获得性耐药,目前引起EGFR-TKIs获得性耐药的机制仍未完全阐明。大量研究表明microRNAs的异常表达在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用,也有越来越多的研究证实microRNAs与EGFR-TKIs获得性耐药相关。本研究旨在探讨miR-335-3p是否影响非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的敏感性,是否通过负向调控RAP1B、CTHRC1、SMYD2的表达抑制肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力,为非小细胞肺癌患者出现EGFR-TKIs获得性耐药后治疗的新方向提供实验依据。方法:(1)构建HCC827GR细胞株,用CCK-8法检测HCC827与HCC827GR对吉非替尼的敏感性,用克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验检测HCC827与HCC827GR的增殖、迁移及侵袭能力。(2)用Real-time PCR检测miR-335-3p 在 HCC827 与 HCC827GR 中的表达。(3)在 HCC827GR 中过表达miR-335-3p后,用CCK-8法检测其对吉非替尼的敏感性的影响,用克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验检测其对增殖、迁移及侵袭能力的影响;在HCC827中敲弱miR-335-3p后,用CCK-8法检测其对吉非替尼的敏感性的影响。(4)查阅 TargetScan 预测 miR-335-3p 的靶基因,用 Real-time PCR 检测 RAP1B、CTHRC1、SMYD2在HCC827与HCC827GR中的表达,以及miR-335-3p过表达对于HCC827GR中 RAP1B、CTHRC1、SMYD2 的表达的影响。(5)在 HCC827GR 中敲弱 RAP1B、CTHRC1、SMYD2后,用克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验检测其对增殖、迁移及侵袭能力的影响,用CCK-8法检测其对吉非替尼的敏感性的影响。结果:(1)HCC827的吉非替尼半抑制浓度为2.39μmol/L,对吉非替尼较为敏感,而HCC827GR的吉非替尼半抑制浓度为15.97μmol/L,对吉非替尼敏感性明显下降;HCC827GR的增殖、迁移及侵袭能力较HCC827明显增强(P<0.001)。(2)miR-335-3p 在 HCC827GR 中的表达较 HCC827 明显下调(P<0.001)。(3)miR-335-3p过表达明显增加HCC827GR对吉非替尼的敏感性,其差异在10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L三个浓度均具有统计学意义(P<0.05);miR-335-3p过表达减弱HCC827GR的增殖、迁移及侵袭能力(P<0.01);敲弱miR-335-3p降低HCC827对吉非替尼的敏感性,其差异在0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L三个浓度均具有统计学意义(P<0.05)。(4)TargetScan 提示 RAP1B、CTHRC1、SMYD2 的 3’-UTR 存在 miR-335-3p的潜在结合位点,RAP1B、CTHRC1、SMYD2在HCC827GR中的表达均较HCC827上调(P<0.01),miR-335-3p 负向调控 RAP1B、CTHRC1、SMYD2 的表达。(5)敲弱RAP1B、CTHRC1、SMYD2减弱HCC827GR的增殖、迁移及侵袭能力(P<0.01),但未能增加HCC827GR对吉非替尼的敏感性。结论:miR-335-3p影响非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的敏感性,并且可能通过负向调控RAP1B、CTHRC1、SMYD2的表达抑制肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力,提示miR-335-3p过表达或许能够成为非小细胞肺癌患者出现EGFR-TKIs获得性耐药后治疗的新方向,但需进一步深入的研究及临床试验来证实。