华支睾吸虫(Clonorchissinensis,Cs)，又称肝吸虫(liverfluke)，寄生在人和多种哺乳动物的肝胆管内，可引起胆管局限性扩张、胆管上皮增生、胆管炎、肝硬化甚至诱发肝胆管肿瘤。全世界将近3500万人感染华支睾吸虫，我国目前感染人数为1249万，分布在除西北几个省区外的25个省市，且呈上升之势，成为我国一个比较严重的公共卫生问题。 因此，华支睾吸虫病的防治及相关的基础研究受到了政府和研究机构的日益重视，通过对华支睾吸虫基因组和功能基因组的研究寻找有价值的诊断和疫苗候选分子成为华支睾吸虫病综合防治的基础。 本研究从全长cDNA质粒文库中挑选出来一个免疫诊断和疫苗候选分子—华支睾吸虫RhoGTPase基因。RhoGTPase为一群分子量接近和同源性较高的蛋白，它们广泛存在于人类、动物、植物以及真菌等生物体内，在细胞的信号转导通路中作为信号转换器或分子开关，作用于靶蛋白而产生细胞骨架运动、转录、细胞生长和凋亡等多种生物效应。在所有的真核生物中，这群高度保守的基因在错综复杂的生化网络中控制着细胞生物活动的基本过程：形态、极化、运动和分裂等等。 华支睾吸虫RhoGTPase基因首先在本实验室被克隆和表达，对其功能和应用方面的研究国内外都未见报道。 研究目的根据对CsRhoGTPase基因全长结构和生物信息学分析，进行克隆、表达和免疫学功能初步研究，探讨CsRhoGTPase在华支睾吸虫病诊断和防治上的意义。 研究方法1华支睾吸虫成虫CsRhoGTPase基因及编码蛋白的结构与功能分析从华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库中选择CsRhoGTPase基因，克隆号为CS007c11。利用生物信息学分析软件(包括BLASTx、RPS-BLAST、InterProScan、ProtPearamtool等)对CsRhoGTPase的cDNA序列和氨基酸序列进行结构和功能分析，包括核酸水平和氨基酸水平的同源性分析，以及推导的CsRhoGTPase蛋白的理化性质及一级结构、二级结构和三级结构抗原表位，根据分析结果确定表达策略。 2华支睾吸虫成虫CsRhoGTPase基因的扩增、克隆和表达 2.1华支睾吸虫成虫CsRhoGTPase基因的扩增、克隆根据目的基因的ORF和原核表达质粒pET-30a(+)设计引物，PCR扩增CsRhoGTPase基因的cDNA全长编码区。用定向克隆方法将其编码区cDNA序列连接到质粒pET-30a(+)中，用PCR、酶切及测序鉴定。 2.2重组蛋白的表达纯化将重组质粒pET-30a(+)-CsRhoGTPase转化大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下表达，用SDS-PAGE鉴定是否有融合蛋白表达，亲和层析获得纯化的CsRhoGTPase重组蛋白。 3CsRhoGTPase重组蛋白的免疫学功能初步研究 3.1CsRhoGTPase重组蛋白的免疫反应性鉴定将获得的CsRhoGTPase蛋白，通过SDS-PAGE电泳和Westernblot方法，一抗用感染华支睾吸虫的猫血清(1：100稀释)观察感染血清对重组蛋白的识别能力。 3.2CsRhoGTPase重组蛋白的免疫原性及抗Cs囊蚴的攻击感染初步研究：用CsRhoGTPase重组蛋白免疫SD大鼠，经过基础免疫和加强免疫后用Cs囊蚴攻击感染，查见Cs虫卵后处死大鼠，与对照组比较成虫数、虫卵数的差异。取血清用ELISA法进行血清抗体水平鉴定。 研究结果1华支睾吸虫成虫CsRhoGTPase基因及编码蛋白的结构与功能分析CsRhoGTPase全长基因为868bp，ORF从第112bp到第688bp，起始密码子为ATG、终止密码子为TAA，完整阅读框含576bp，根据Blastx分析，该ORF就是其完整的CDS，编码192aa，理论分子量为21，700，pI=7.55(图1)。BLASTP分析表明，该基因序列与人RhoAGTPase的一致性为70％，同源性为82％；与曼氏血吸虫(Schistosomamansoni)和日本血吸虫(Schistosomajaponicum)的RhoA基因序列一致性分别为66％和68％。同源性分别为79％和80％，并具有与人和其他真核生物RhoGTPases家族一致的特征性序列(GTP酶活性域、Rho插入域及C末端CAAX模序等)，初步判定该基因为华支睾吸虫RhoGTPase样基因。 2华支睾吸虫成虫CsRhoGTPase基因的扩增、克隆和表达用设计的引物PCR从质粒cDNA文库中扩增CsRhoGTPase编码区cDNA序列，用琼脂糖电泳鉴定在微大于500bp处，测序确定为576bp。定向克隆获得的重组原核表达质粒pET-30a(+)-CsRhoGTPase经PCR、双酶切和测序证实构建成功。重组质粒在IPTG终浓度1mmol/L，37℃下诱导表达可溶性重组融合蛋白，经SDS-PAGE显示与理论预测的融合蛋白分子量约30,000相符。 3CsRhoGTPase重组蛋白的免疫学功能初步研究Westernblot证实自然感染华支睾吸虫的猫血清能识别原核表达的CsRhoGTPase蛋白。初步研究表明，CsRhoGTPase重组蛋白免疫组能较好的抵抗Cs囊蚴的攻击感染，其机制可能与其诱导Th1和Th2免疫应答有关。 研究结论CsRhoGTPase重组蛋白具有免疫原性和免疫反应性，是具有潜力的诊断和疫苗候选抗原。