研究目的1.本课题根据蒙医文献记载及前期研究基础上提出蒙医灸疗法可能对老年性痴呆模型AD大鼠有保护和改善脑神经细胞损伤,改善脑神经功能回复的假设,采用蒙医灸疗法治疗AD大鼠的实验研究方法,阐明蒙医灸疗法对老年性痴呆病的治疗作用及其机理。2.采用大鼠皮下注射D-半乳糖和双侧海马注射Aβ25-35建立大鼠老年性痴呆病理模型,以蒙医“顶会穴”、“心穴”和“胃穴”为切入点,设置正常组、假手术组、模型组、灸疗组和西药组,观察灸疗法对AD大鼠的学习记忆能力、相关胆碱、氧化、自由基酶的含量,脑组织神经细胞病理改变、脑组织相关基因的mRNA和蛋白表达的影响,阐明蒙医灸疗法治疗AD的作用及其机理。研究方法1.动物选择及筛选方法：选用体质量220±20(g)、健康清洁级雄性SD大鼠,将大鼠分别进行MorriS水迷宫测试,剔除天生痴呆大鼠,选出合格大鼠70只。2.大鼠分组及造模：将70只大鼠按体质量随机分为5组,正常组、假手术组、模型组、灸疗组和西药组,每组14只。前6周：模型组、灸疗组和西药组三组大鼠均颈背部皮下注射D-半乳糖(150mg/kg.d);假手术组颈部皮下注射生理盐水(150mg/kg.d),每天一次,连续6周；正常组不予处理。第7周开始：除正常组外其余四组大鼠立体定位海马,进行颅脑手术,模型组、灸疗组和西药组三组大鼠将准备好的聚集态Aβ25-35(浓度10ug/ul)缓慢注入双侧海马,每侧luL在5min内注入。假手术组双侧海马注入等剂量的无菌生理盐水；正常组不予处理。3.模型成功检测方法：造模完成2天后进行水迷宫实验,得出造模后大鼠的平均逃避潜伏期。凡每只大鼠的平均逃避潜伏期较造模前下降1/3者为造模成功。只有模型成功者才进入下一步实验,若出现死亡或不符合条件的大鼠则予以剔除,并遵循随机原则补齐动物。4.治疗方法：造模成功后,开始治疗。灸疗组大鼠取其“顶会穴”、“心穴”和“胃穴”,每日一穴,每次治疗15mmin,自贴式艾柱施灸,三穴交替,10天为-疗程,一疗程后休一天,再治疗,共治疗2个疗程：西药治疗组给予临床治疗老年性痴呆的药物吡拉西坦片(脑复康)0.92mg/kg灌胃,共治疗20天；模型组和假手术组大鼠与灸疗组相同的抓取和固定,并与西药组相同剂量的生理盐水灌胃；正常组不给予任何处理。5.取材与指标检测：治疗结束后,全部大鼠进行迷宫实验、取材和指标检测。(1)每组14只大鼠均采用Morris水迷宫实验进行行为学测试,计算出每只大鼠平均逃避潜伏期、经过平台次数及经过有效区域的比例；(2)每组4只大鼠进行心脏灌注固定后进行Nissl和TUNEL染色检测海马神经元的变化,损伤情况及凋亡情况；(3)每组10只大鼠麻醉,置于冰盒上分离皮质和左侧海马,称重,冻存,采用紫外分光光度计,测定皮质和海马组织的MDA含量和SOD、ChAT、 AchE的活性含量。(4)每组6只大鼠麻醉,置于冰盒上分离右侧海马,称重,冻存,采用实时定量RT-PCR方法检测海马组织Bcl-2、Bax的mRNA转录水平；采用Western Blot法测定海马组织Bcl-2、Bax的蛋白表达。6.统计学处理：采用SPSS19.0软件进行统计学处理,数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较用F检验,组间两两比较用LSD检验,P<0.05为显著性差异。结果1.蒙医灸疗法对AD大鼠学习记忆行为学的影响(1)治疗结束后,各组大鼠定位航行试验,“1-5天平均潜伏期”和“经过有效区域比例”比较,模型组与正常组比较“1-5天平均潜伏期”显著延长(P<0.05)、“经过有效区域比例”显著减少(P<0.05),模型组与假手术组比较“1-5天平均潜伏期”显著延长(P<0.01)、“经过有效区域比例”显著减少(P<0.01),表明AD模型制作成功；灸疗组、西药组与模型组比较,“1-5天平均潜伏期”均显著缩短(P<0.01)、灸疗组与模型组比较,“经过有效区域比例”显著提高(P<0.01),西药组与模型组比较,“经过有效区域比例”无显著差异(P>0.05),表明蒙医灸疗和西药对AD学习记忆功能有提高作用。(2)治疗结束后,各组大鼠空间搜索试验,“经过平台所在区的次数”、“经过有效区域比例”比较,模型组与正常组比较“经过平台所在区的次数”和“经过有效区域比例”均显著减少(P<0.05)、模型组与假手术组比较“经过平台所在区的次数”和“经过有效区域比例”均显著减少(P<0.01),表明AD模型制作成功；灸疗组与模型组比较,“经过平台所在区的次数”和“经过有效区域比例”均显著提高(P<0.01),西药组与模型组比较,“经过平台所在区的次数”显著提高(P<0.01),“经过有效区域比例”无显著差异(P>0.05),灸疗组与西药组比较“经过有效区域比例”有显著增多(P<0.05)。提示蒙医灸疗对AD记忆功能有显著作用,且比西药(吡拉西坦片)有略优于的趋势。2.蒙医灸疗法对AD大鼠海马神经细胞的影响(1) Nissl染色结果显示：与正常组和假手术组相比,模型组大鼠大脑海马区Nissl小体的数量明显减少(P<0.01),染色较浅,排列不齐,表明AD模型制作成功；经吡拉西坦片治疗后,Nissl染色形态学观察指标较模型组明显改善(P<0.05)；蒙医灸疗法治疗后,大鼠海马区Nissl染色较深,Nissl小体的数量明显增加(P<0.01),排列也较有序；蒙医灸疗法与西药组比较,Nissl染色较深,Nissl小体的数量明显比西药组多(P<0.05)。表明,蒙医灸疗法和西药治疗能减轻AD神经元的损伤,并蒙医灸疗法作用优于吡拉西坦。(2) TUNEL染色结果显示：正常组和假手术组大鼠海马区可偶见TUNEL阳性细胞,而模型组大鼠海马区存在较多的TUNEL阳性细胞(P<0.01),表明,AD模型制作成功；经吡拉西坦片治疗后,大鼠海马区阳性细胞较模型组有所减少(P<0.01),蒙医灸疗组偶见阳性细胞,与模型组对照有明显减少(P<0.01),蒙医灸疗组与西药组比较,TUNEL阳性细胞比西药组明显少(P<0.05)。表明,蒙医灸疗法和西药治疗均能逆转AD神经细胞的凋亡,并蒙医灸疗法的作用优于吡拉西坦片。3.蒙医灸疗对AD大鼠的脑组织MDA、SOD和ChAT、AchE的影响(1)各组大鼠大脑皮质和海马组织内SOD、MDA的测定①各组大鼠皮质和海马组织的SOD活性比较,与正常组和假手术组比较,模型组皮质和海马SOD活性显著降低(P<0.01),灸疗组、西药组与模型组比较,皮质和海马SOD活性均有显著提高(P<0.01),西药组与灸疗组之间比较无显著差异(P>0.05)；假手术组与正常组比较,皮质和海马SOD活性有显著提高(P<0.01,P<0.05)。②各组大鼠皮质和海马组织的MDA含量比较,与正常组和假手术组比较,模型组皮质和海马MDA含量均显著提高(P<0.01),灸疗组、西药组与模型组比较,皮质和海马MDA均有显著降低(P<0.01),西药组与灸疗组之间比较无显著差异(P>0.05)；假手术组与正常组比较,皮质MDA含量有显著减少(P<0.01),海马MDA含量无显著差异(P>0.05)。(2)各组大鼠大脑皮质和海马组织内ChAT、AchE的测定①各组大鼠大脑皮质和海马组织的ChAT活性比较,与正常组和假手术组比较,模型组皮质和海马ChAT活性均显著降低(P<0.01),灸疗组、西药组与模型组比较,皮质和海马ChAT活性均有显著提高(P<0.01),西药组与灸疗组之间比较无显著差异(P>0.05)；假手术组与正常组比较无显著差异(P>0.05)：灸疗组与正常组比较,皮质ChAT活性有显著差异(P<0.05)。西药组与正常组和假手术组比较,皮质和海马ChAT活性均有显著降低(P<0.01)。②各组大鼠大脑皮质和海马组织的AchE舌性比较,与正常组和假手术组比较,模型组皮质和海马AchE活性均显著降低(P<0.01),灸疗组、西药组与模型组比较,皮质和海马AchE活性均有显著提高(P<0.01),西药组与灸疗组之间比较无显著差异(P>0.05)；假手术组与正常组比较无显著差异(P>0.05)。4.蒙医灸疗法对AD大鼠海马组织Bcl-2、Bax的：mRNA和蛋白表达的影响(1)各组大鼠海马组织Bcl-2的mRNA和蛋白表达比较,与正常组和假手术组比较,模型组Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.01),灸疗组、西药组与模型组比较,Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平有显著提高(P<0.01、P<0.05),西药组与灸疗组之间比较无显著差异(P>0.05)；假手术组与正常组比较,无显著差异(P>0.05)。(2)各组大鼠海马组织Bax的mRNA和蛋白表达比较,与正常组和假手术组比较,模型组Bax的mRNA和蛋白表达水平显著提高(P<0.01),灸疗组和西药组与模型组比较,Bax的mRNA和蛋白表达水平均有显著降低(P<0.01),西药组与灸疗组之间比较无显著差异(P>0.05)；假手术组与正常组比较,无显著差异(P>0.05)。结论1.本研究采用大鼠皮下注射D-半乳糖和双侧海马注射Aβ25-35建立大鼠老年性痴呆模型,能较好的模拟AD学习记忆障碍、神经元损伤、神经细胞凋亡等行为学和病理学方面的特征,更接近AD的病理表现,具有较好的定位性和实用性。2.蒙医灸疗法能改善AD大鼠的行为学功能,提高学习和记忆能力,对AD有防治作用。3.蒙医灸疗法能降低AD大鼠大脑海马组织神经细胞的损伤,抑制神经细胞的凋亡,对AD有防治作用。4.蒙医灸疗法能提高AD大鼠脑组织的SOD活性,降低MDA含量,减轻脂质过氧化反应,提高抗氧化酶活性,清除自由基,抗衰老,从而防治AD病的发生和发展。5.蒙医灸疗法能提高AD大鼠脑组织的ChAT、AchE的活性,保护脑组织酶活性,改善脑组织能量代谢障碍,从而可能改善AD的胆碱能系统功能障碍。6.蒙医灸疗法对AD大鼠海马组织的Bcl-2的mRNA和蛋白有上调作用,对Bax的mRNA和蛋白有下调作用,对AD的脑神经细胞凋亡有很好的抑制作用。7.对AD大鼠的蒙医“顶会穴”、“心穴”和“胃穴”实施蒙医灸疗法后,有改善学习记忆功能,减少大脑海马神经细胞的损伤,抑制神经细胞凋亡等作用,其作用机理与提高大脑组织SOD活性、减少MDA含量,提高ChAT、AchE的活性和上调海马组织中Bcl-2的mRNA和蛋白表达,下调Bax的mRNA和蛋白表达等有密切关系。8.蒙医灸疗法与西药(吡拉西坦片)对AD大鼠的治疗作用比较,蒙医灸疗在改善学习记忆及海马神经细胞抗凋亡方面有较明显的作用,证明蒙医灸疗法对AD的作用较优于吡拉西坦片的趋势。