第一部分：促炎因子对ADAMTS-4的调节作用及机制研究研究背景：椎间盘由位于内层的胶冻状的髓核(Nucleus pulposus, NP)及外层的纤维环（Annulus fibrosus, AF）组成，髓核细胞由脊索（一种血供有限的胚胎组织）分化而来，参与分泌蛋白多糖和各型胶原等多种细胞外基质，纤维环细胞由间充质细胞分化而来，可与髓核细胞一道协同传导相邻椎体间的压力。除了参与了脊柱的屈、伸、旋转等运动，维持椎间盘高度之外，椎间盘的生理功能还包括承载负荷以及分散应力等。目前已经公认，促炎因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）等在椎间盘退变过程中起着非常重要的作用，在退变椎间盘内可以检测到TNF-α、IL-1β表达显著升高,上述炎症因子可刺激与髓核细胞神经长入及血管生成的分子如神经生长因子Nerve growth factor, NGF),脑源性神经营养因子(brain derived neurophicfactor, BDNF)和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等的产生，同时在髓核细胞中这两种炎症因子还可以上调基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)及两种主要的蛋白聚糖酶(ADAMTS-4和ADAMTS-5)的表达。ADAMTS-4全称A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondinmotif-4,意为含血小板结合蛋白基序(TSP)的解聚蛋白样金属蛋白酶4，是继基质金属蛋白酶MMPs后新发现的一种Zn2+依赖的分泌型金属蛋白酶。在ADAMTS家族几个能够降解蛋白聚糖的成员中，由于ADAMTS-4（蛋白聚糖酶1）及ADAMTS-5（蛋白聚糖酶2）可能在蛋白聚糖的降解及随之而来的椎间盘退变及骨关节炎中起到重要作用而吸引了广泛的关注，值得注意的是，尽管ADAMTS-4在骨关节炎及椎间盘退变性疾病中具有很重要的意义，然而有关ADAMTS-4在椎间盘内的表达及具体调控机制尚未有相关研究报道。本实验研究首次证实了在椎间盘髓核细胞内，促炎因子TNF-α及IL-1β通过MAPK及NFκB信号通路控制ADAMTS-4的表达。目的：探讨ADAMTS-4在椎间盘髓核细胞及纤维环细胞中的表达情况，研究促炎因子对ADAMTS-4表达的调节作用，系统探讨TNF-α，IL-1β对ADAMTS-4调节作用的可能信号传导通路（MAPK及NFκB传导通路）的激活情况、作用靶点及相关的分子机制。方法：采用实时定量逆转录多聚酶链反应（Real-time RT-PCR）和免疫印迹(Western Blot)方法检测健康大鼠髓核及纤维环组织ADAMTS-4的表达水平；体外培养大鼠髓核细胞，使用TNF-α（25ng/ml,50ng/ml,100ng/ml）、IL-1β （5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml）处理髓核细胞24小时后检测ADAMTS-4mRNA及蛋白水平表达的变化。使用XhoI及HindIII两种限制性内切酶将3.5kb ADAMTS-4启动子片段从ADAMTS-4-pβ-gal-Basic质粒中切出后克隆至空白pGL3载体中从而获得ADAMTS-4萤火虫荧光素酶启动子报告基因质粒。使用该质粒转染髓核细胞并检测促炎因子对ADAMTS-4启动子水平的调节作用；使用Western Blot方法检测促炎因子TNF-α及IL-1β作用于髓核细胞后相关通路激活情况，主要通过MAPK组成通路p38, ERK, JNK及NFχB信号传导通路亚基p65的磷酸化情况来观察MAPK及NFχB传导通路激活情况；采用Real-time RT-PCR和Western Blot方法检测应用p38, ERK, JNK及NFκB抑制剂处理髓核细胞对ADAMTS-4表达的调节作用；应用p38传导通路显性负突变（Dominant negative）质粒（DN-p38α，DN-pβ2， DN-p38β及DN-p38γ）及ERK传导通路显性负突变质粒DN-ERK1及DN-ERK2转染髓核细胞以进一步明确MAPK传导通路对ADAMTS-4表达调控的作用机理。使用LIP及LAP2转染髓核细胞以明确C/EBP-在介导于炎症因子的ADAMTS-4转录过程中的作用。使用NF B传导通路各亚基（RelA/p65, p50, RelB及c-Rel）过表达（over-expression）质粒和ADAMTS-4启动子质粒共转染髓核细胞以明确NFκB传导通路具体作用情况；采用NFκB传导通路显性负突变质粒I B M(DN-NFκB)共转染大鼠髓核细胞以明确NFκB传导通路的作用机理；使用NFκB传导通路特异性抑制剂SM7368处理髓核细胞以进一步研究NF B传导通路对ADAMTS-4启动子活性的调节情况。通过细胞转染检测促炎因子TNF-、IL-1β在RelA/p65野生型（Wild Type）及敲除突变（null）的成纤维细胞中对ADAMTS-4的调节作用。结果：Real-time RT-PCR和Western Blot结果显示成熟大鼠髓核及纤维环组织中均有ADAMTS-4表达，在生理情况下，ADAMTS-4的表达水平很低，使用促炎因子TNF-及IL-1处理大鼠及人髓核细胞后，ADAMTS-4的表达水平升高（p<0.05），且促炎因子对ADAMTS-4mRNA的诱导作用具有剂量依赖性（p<0.05）。促炎因子可以提高ADAMTS-4启动子的活性（p<0.05）。Western Blot结果显示，促炎因子TNF-α及IL-1β可以通过p38, ERK, JNK及p65的快速磷酸化从而激活MAPK及NF B通路。使用MAPK组成通路p38, ERK, JNK抑制剂SB203580(10μM) or PD98059(10μM) or SP60025(10μM)及NFκB通路抑制剂SM7368处理髓核细胞后，促炎因子对ADAMTS-4及ADAMTS-5mRNA及蛋白水平的诱导作用被完全抑制（p<0.05）。使用DN-p38α，DN-pβ2，DN-p38γ及DN-ERK1共转染后，促炎因子对ADAMTS-4启动子活性的诱导作用被抑制（p<0.05）；与之相反，DN-p38β及DN-ERK2对ADAMTS-4启动子的活性没有影响（p>0.05）。使用过表达p65/RelA质粒转染髓核细胞后，ADAMTS-4启动子活性升高（p<0.05），RelB及c-Rel对ADAMTS-4启动子活性没有作用（p>0.05）；使用过表达p65/RelA和/或p50质粒转染髓核细胞后，只有p65/RelA可以提高ADAMTS-4启动子活性，p50对ADAMTS-4启动子活性没有作用（p>0.05）。p50可以完全抑制p65对ADAMTS-4启动子活性的诱导作用（p<0.05）,此外，p50还可以抑制促炎因子TNF-α及IL-1β对ADAMTS-4启动子活性的诱导作用（p<0.05）。使用NFβB通路抑制剂SM7368处理髓核细胞后，促炎因子对ADAMTS-4启动子活性的诱导作用被完全抑制（p<0.05）；与之相似，使用IκBα M共转染后，促炎因子对ADAMTS-4启动子活性的诱导作用被抑制（p<0.05）；将ADAMTS-4启动子质粒转染RelA/p65野生型及敲除突变的成纤维细胞后，结果显示促炎因子可以提高野生型细胞中ADAMTS-4启动子的活性（p<0.05），而对p65敲除突变的细胞中ADAMTS-4启动子的活性则没有影响（p>0.05）。结论：1. ADAMTS-4在成熟大鼠髓核组织及纤维环组织中均有表达，在生理状态下，ADAMTS-4在大鼠椎间盘组织中的表达水平很低。2.促炎因子TNF-和IL-1在mRNA以及蛋白水平对ADAMTS-4的表达均有正调节作用，且这种调节作用具有剂量依赖性。3.促炎因子TNF-和IL-1在转录水平对ADAMTS-4启动子活性具有诱导作用。4. TNFα和IL-1β对ADAMTS-4表达的调节是通过激活MAPK及NF B信号通路起作用的，MAPK传导通路对ADAMTS-4表达的调节具有亚型特异性的特点； NFκB传导通路对ADAMTS-4表达调节的作用靶点主要为p65亚基，p50则能够抑制促炎因子及p65对ADAMTS-4启动子活性的诱导作用。第二部分：ADAMTS-4在椎间盘退变中的作用及机制研究研究背景:腰痛(Low Back Pain)是一种可由多种疾病如腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症、腰椎滑脱症及退变性腰椎侧弯症等导致的与椎间盘退变(Intervertebral DiscDegeneration, IVDD)密切相关的极为常见的临床疾病，目前公认椎间盘退变主要是由细胞外基质如蛋白聚糖、Ⅱ型胶原的合成代谢与分解代谢的不平衡造成的，具体表现为：蛋白聚糖(以聚集蛋白聚糖Aggrecan为主)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)等基质大分子的减少及椎间盘髓核细胞数量减少和功能降低，最终导致椎间盘应力改变和椎间高度丢失从而造成椎间盘的生物力学功能丧失。尽管人们已经越来越意识到蛋白聚糖的合成及分泌在椎间盘功能中的重要性，无论在正常椎间盘还是退变椎间盘中，调节蛋白聚糖降解的分子机制还没有研究清楚。相关研究结果表明：在椎间盘退变及突出的过程中，髓核细胞分泌了大量的促炎症因子如TNF-α和IL-1β，而在髓核细胞中这两种炎症因子还可以上调两种主要的蛋白聚糖酶(ADAMTS-4和ADAMTS-5)的表达。在ADAMTS家族的众多成员中，目前普遍认为ADAMTS-4和ADAMTS-5最有可能在蛋白聚糖降解及随之而来的骨性关节炎中及椎间盘退变的过程中起到重要作用。值得注意的是，尽管ADAMTS-4和ADAMTS-5在骨关节炎及椎间盘退变性疾病中具有很重要的意义，关于ADAMTS-4和ADAMTS-5在椎间盘退变中的具体作用机理及二者在椎间盘退变中的相对贡献目前尚无明确报道。因而，进一步深入探讨并阐明ADAMTS-4和ADAMTS-5在椎间盘退变过程中的作用及具体机制，为下一步延缓乃至阻止椎间盘退变提供可能的分子生物学治疗依据具有重要的意义。目的：研究NF-κB信号通路在椎间盘退变中的作用机理，探讨ADAMTS-4和ADAMTS-5在椎间盘退变中的作用及相对贡献，为下一步针对椎间盘退变的靶向治疗提供分子生物学依据。方法：通过慢病毒载体介导的NF-B通路亚基p65、p52、IKKα及IKKβshRNA来抑制NF-κB在髓核细胞中的表达以进一步阐明NF-κB信号通路在髓核细胞中对ADAMTS-4及ADAMTS-5表达的调控作用。使用激光共聚焦显微镜检测转染了慢病毒的髓核细胞中的黄色荧光蛋白YFP来保证转染的有效性。应用Western blot方法确认p65，p52I，KKα，IKKβ在髓核细胞中的表达被成功抑制后使用Western blot的方法对ADAMTS-4, ADAMTS-5及ADAMTS4/5特异的蛋白聚糖降解产物ARGSVIL的表达进行了检测。构建sh-ADAMTS-4及sh-ADAMTS-5慢病毒载体并转染人髓核细胞。应用Western blot方法确认ADAMTS-4及ADAMTS-5在髓核细胞中的表达被成功抑制；然后检测TNF-α刺激后蛋白聚糖降解产物ARGSVIL, NITIGE水平的变化。结果：成功构建sh-p65、sh-p52、sh-IKKα、sh-IKKβ慢病毒载体并转染人髓核细胞，使用激光共聚焦显微镜检测黄色荧光蛋白YFP，结果提示转染效率高于90%，且细胞生长未受影响。Western Blot检测转染髓核细胞中p65、p52、IKKα及IKKβ在蛋白水平的表达，结果显示：相比于对照组（LV-shC）, sh-p65、sh-p52、sh-IKKα、sh-IKKβ组相应各亚基的表达水平下降。灰度分析结果显示，相对于对照组，sh-p65、sh-p52、sh-IKKα、sh-IKKβ组相应各亚基的生成被抑制；使用TNF-处理慢病毒转染后的细胞，结果显示sh-p65、sh-p52、sh-IKKα、sh-IKKβ可阻断TNF-α对ADAMTS-4,ADAMTS-5及蛋白聚糖降解产物ARGSVIL表达的诱导作用。成功构建sh-ADAMTS-4及sh-ADAMTS-5慢病毒载体。应用Western Blot检测转染后条件培养基组及细胞蛋白组中ADAMTS-4及ADAMTS-5的表达水平，结果显示，相比于对照组（LV-shC），sh-ADAMTS-4及sh-ADAMTS-5组相应蛋白的表达水平下降。通过Western Blot方法检测使用TNF-处理慢病毒转染后髓核细的胞蛋白聚糖降解产物ARGSVIL和NITIGE的表达情况，结果显示sh-ADAMTS-4及sh-ADAMTS-5可阻断TNF-α对蛋白聚糖降解产物ARGSVIL和NITIGE表达的诱导作用。结论：1.敲除NF-B信号通路各亚基可阻断TNF-对ADAMTS-4、ADAMTS-5及蛋白聚糖降解产物ARGSVIL表达的诱导作用。2.敲除ADAMTS-4或ADAMTS-5均可减少人髓核细胞中蛋白聚糖的降解（p<0.05）。