DNA的损伤类型各异,尤为严重和致命的当属DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs),机体主要通过同源重组修复来保证基因组的完整性。同源重组是一种分子过程,在各种生物DNA代谢中具有多重作用,一般情况下,发生在DNA分子之间。通过同源重组修复机制,可精确编辑基因组序列,实现目标基因的定向编辑,应用于安全动物育种。同时对肿瘤等疾病的防治意义重大,在基因治疗方面优势明显。自然界各个物种细胞中,均存在有大量的DNA和RNA分子,且RNA分子的数量和种类远胜于DNA分子。考虑到细胞中RNA转录产物的丰度,RNA可能会对基因组的稳定性和可塑性产生影响。在纤毛虫、细菌及酵母细胞中,已有相关报道指出:RNA能够直接与DNA进行同源互作,对DNA损伤进行修复,而在哺乳动物细胞中还未见相关可供参考的研究报道出现。因此,本论文主要对哺乳动物细胞中是否存在以RNA为模板的DNA编辑和改造过程进行了尝试性地探讨,期望能在哺乳动物细胞DNA复制和修复过程中发现与酵母细胞等类似的RNA-DNA互作效应,为其DNA损伤修复机制提供一个新的途径。其次,对不同CRISPR/Cas9系统核酸酶活性高低进行比较,构建得到一套工作效率相对较高的打靶系统,为未来关于RNA介导重组的探索过程,提供有效的技术手段,创造更高效的双链断裂效应,从而提高基因编辑效率。在报告载体水平,设计并构建获得以β-actin基因外显子3(exon3)&外显子4(exon4)、外显子3(exon3)&外显子5(exon5)为DNA重组修复模板的融合有eGFP报告基因的Actin E3&4和Actin E3&5两种同源重组报告系统,与Cas9-sgRNA表达载体共转染HEK293T细胞,在细胞内源转录产物β-actin mRNA的同源介导下,实现β-actin基因的精确修复。实时荧光观察后提取细胞基因组,设置不同策略的PCR鉴定。在分子水平上并未检测到相应的RNA编辑结果。设计并构建piggy Bac-报告载体,与转座酶载体稳转293A细胞系,遗传霉素(G418)筛选后成功构建获得随机整合报告细胞系pB-293A。在细胞系基因组水平,将Cas9-sgRNA打靶载体和在细胞内表达eGFP mRNA同源模板的供体载体共转染,利用博来霉素(zeocin)筛选富集阳性细胞,测序鉴定。鉴定结果表明,富集得到的细胞样品中,并未检测到经过精确编辑的阳性结果。分别设计并构建有关sgRNA二级结构、sgRNA 5’端酶切位点及hst Ca9和hspCas9的相关CRISPR/Cas9表达载体,与SSA报告载体共转入HEK293T细胞,通过流式细胞术计数检测,量化分析报告载体水平不同CRISPR/Cas9系统的工作效率,比较得出sgRNA二级结构较为稳定的hstCas9系统核酸酶活性相对较高,为21.15%。哺乳动物细胞中,由于系统检测灵敏度等原因,无论在载体水平还是基因组水平,均未检测到RNA模板介导的同源重组修复阳性结果。在目前并无相关可供参考的文献报道的前提下,这种关于哺乳动物细胞中能否发生RNA与DNA直接的同源互作及遗传信息交流的探索过程,具有一定的科研选题独特性和创新性,可以为以后针对该系统的优化设计提供借鉴,同时为未来开展相关的研究提供思路。