TF/VIIa/PAR2轴对结肠癌细胞增殖迁移的影响以及相关信号通路的研究

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目的:探讨结肠癌SW620细胞系中,TF/Ⅶa/PAR2轴的激活对细胞增殖、侵袭、凋亡的影响;探讨TF/Ⅶa/PAR2轴效应对凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、黏附分子CD44表达的影响;探讨钙信号通路、MAPKs/NF-κB信号转导通路在TF-FⅦa/PAR2轴效应中的作用。方法:(1)Ⅶa (10nM)及PAR2激动剂(PAR2-AP,100μM)等处理SW620细胞,细胞计数法检测细胞增殖能力;、vound healing法检测细胞迁移能力。分析Ⅶa及PAR2-AP对SW620细胞增殖与迁移的影响。(2)采用实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附实验(ELISA)和流式细胞术(FCM)检测Ⅶa(10nM)及PAR2-AP100μM)刺激SW620细胞后MMP-9和CD44分子的表达变化,分析Ⅶa及PAR2-AP对SW620细胞MMP-9和CD44分子表达的影响。(3)实时荧光定量PCR和Western blotting检测Ⅶa(10nM)、PAR2-AP(100μM))PAR2拮抗剂(PAR2-aAP,100μM)抗-TF抗体(a-TF,10μg/ml)、同型对照抗体MOPC-21(10μg/ml)等不同组合刺激SW620细胞后caspase-3表达的变化。分析Ⅶa对caspase-3表达n的影响以及足子依赖细胞农面的PAR2和TF。(4)利用p38MAPK抑制剂(SB203580,10μM)、ERK1/2抑制剂(U0126,10μM)和NF-κB抑制剂(PDTC,5μM)分别预处理细胞30min,观察这些抑制剂对Ⅶa及PAR2-AP调控细胞caspase-3、MMP-9和CD44表达的影响。分析TF/Ⅶa/PAR2轴调控这3个分子表达的相关信号通路。(5)Ⅶa(10nM)及PAR2-AP (100μM)作用负载钙荧光染料fluo-4/AM的SW620细胞,激光共聚焦显微镜检测胞内钙离子荧光强度的变化。观察TF/Ⅶa/PAR2轴效应对钙信号的影响。(6)利用钙整合剂EGTA(1MM)和钙泵抑制剂毒胡萝卜内酯(thapsigargin, TG,1μM)共同预处理SW620细胞后,观察:①钙抑制剂对Ⅶa、PAR2-AP (100μM)调控p-ERK1/2表达的影响。②钙抑制剂对Ⅶa、PAR2-AP调控细胞增殖、细胞周期、细胞迁移的影响。以阐明钙信号在TF/Ⅶa/PAR2轴效应中的作用。结果:(1)Ⅶa (10nM)与PAR2-AP (100μM)均能够明显促进SW620细胞的生长和迁移,与无刺激比较,差异显著(p均<0.05)。(2)Ⅶa(10nM)及PAR2-AP(100μM)均能降低细胞caspase-3mRNA和蛋白的表达,增加MMP-9mRNA和蛋n及CD44的表达。(3)PAR2-aAP(100μM)及a-TF(10μg/ml)均能明显抑制VIIa对细胞caspase-3表达的下调作用,而同型对照抗体MOPC-21(10μg/ml)无此效应。(4)U0126(10μM)和PDTC(5μM)能够显著干预VIIa调控细胞caspase-3、MMP-9和CD44分r表达n的效应;而SB203580(10μM)能够降低Vlla对MMP-9和CD44表达n的刺激效应,但是对caspase-3的农达没有影响。(5)Ⅶa(10μM)和PAR2-AP(100μM)刺激SW620细胞后,胞内鲈离r荧光强度瞬时升高后降低,与无刺激比较,差异显著(p<0.05)。(6)Ⅶa(10nM)和PAR2-AP(100μM)均能上调细胞的p-ERK1/2的农达(F=74.56,P<0.05);而钙抑制剂EGTA和TG能明显抑制Ⅶa、PAR2-AP上调细胞p-ERK1/2蛋白表达的作用(P<0.05)。(7)Ⅶa(10nM)、 PAR2-AP(100μM)均可促进SW620细胞增殖,使得细胞S期比率升高,G0/G1期比率下降(P<0.05),促进细胞迁移(F=78.24,p<0.05);而EGTA和TG能够明显抑制Ⅶa、PAR2-AP促进细胞增殖迁移的作用(p均<0.05)结论:(1)VlIa依赖细胞表面TF和PAR2的活化,促进结肠癌细胞株SW620的增殖迁移。(2)VIIa依赖细胞表面TF和PAR2的活化,下调SW620细胞caspase-3的表达,提高MMP-9和CD44的表达。(3)VIIa依赖细胞表面TF和PAR2的活化,经由ERK1/2和NF-κB信号通路,抑制SW620细胞caspase-3表达,提高MMP-9和CD44的表达,促进细胞的增殖迁移。(4)VIIa依赖TF及PAR2活化,触发SW620细胞内钙信号的激活,进而活化下游ERK1/2信号分子、促进细胞的增殖迁移。(5)VII/TF/PAR2轴经由钙信号通路、MAPKs/NF-κB信号转导,调控关键效应分子的表达,促进结肠癌细胞的增殖与迁移。
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