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前言肺硬化性血管瘤(pulmonary sclerosing hemangioma, PSH)是一种迄今未能确定其组织来源及性质的少见肺肿瘤。PSH组织形态多样,由实性区、乳头区、血管瘤样区和硬化区四种结构构成,并有不同程度的相互移行。但肿瘤细胞主要有两种：一种是呈实性或弥漫成片的多角形间质样瘤细胞,另一种是被覆在乳头表面、血管瘤样区间隙及实变区裂隙内的细胞,多呈矮立方,单层排列。而TTF-1(甲状腺转录因子-1)的共同表达以及通过对两种细胞进行克隆分析,发现两种细胞具有相同的克隆,并且都来源于上皮细胞,且多角形细胞分化不成熟。虽然大多数学者认为该肿瘤有温和的临床经过,是一种“良性肿瘤”,但具有侵袭转移及复发的报道。。另外多角形细胞为什么会形成间质细胞一样的排列方式呢?为什么在正常组织中不存在与其相对应的细胞呢?上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)指是上皮细胞在与周围间质的相互作用过程中逐渐获得了某些间质细胞所特有的性状的现象。它不仅存在于胚胎发生过程中,同时也存在于多种炎性或肿瘤性病变中。其主要特征为上皮细胞极性的丧失及其间质特性的获得。那么间质中的多角细胞是否也发生这种转变呢?本研究首先采检测PSH两种细胞中干细胞标记以及与肺发育相关蛋白的表达情况,来进一步证明其来源和性质,然后又检测了EMT相关因子的表达情况,来探讨PSH的形成机制。材料与方法一、材料收集中国医科大学第一临床学院以及天津市肿瘤医院的肺硬化性血管瘤35例。其中女性26例,男性9例,X-线胸片显示均为孤立性肿块,多位于肺的周边,直径0.6-5cm,未发现多发病灶及转移病例。二、免疫组织化学染色鼠抗人单克隆抗体Notch3, Notch4, Stro-1, p75NGFR, Nestin购自美国Abcam公司,鼠抗人单克隆抗体Axin购自美国Santa公司。即用型鼠抗人单克隆C-myc, TTF-1, TGF-β1, E-cadherin,β-catenin, Vimentin, Actin (sm), MMP2以及MMP9,S-P染色试剂盒及DAB显色液均购自福州迈新公司。将蜡块标本制成4μm连续切片,经脱蜡,脱苯,水化后进行HE和链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶(S-P法)免疫组化染色。三、激光捕获目的细胞、RNA提取将18例两种细胞均较明显的PSH蜡块标本制成6μm连续切片,铺在有薄聚乙烯箔片的载玻片上,脱蜡,染色,然后梯度酒精,二甲苯透明10min。切片晾干,放置在LCM(LEICA LMD6000)系统的显微镜的载物台上。定位光束标定被选细胞,发射激光束,选定的目标细胞群即会落入加有细胞溶解缓冲液的EP管管盖中,分别捕获PSH组织中表面立方细胞和多角形细胞。每份标本分别捕获10000以上个目的细胞。然后将捕获的目的细胞进行提取RNA。四、RT-PCR分析将提取到多角形细胞和表面立方细胞的RNA分别进行RT-PCR。RT-PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳,用自动电泳凝胶成像分析系统(Biolmaging Systems),测定扩增带灰度值,以β-actin为内参照,得到mRNA的相对表达量。五、统计分析各组资料利用SPSS for Window 13.0进行统计分析。p＜0.05有统计学意义。结果一、免疫组化结果1、干细胞标物Stro-1,p75NGFR及Nestin未见明显表达,Notch3和Notch4在多角形细胞中存在着较高的阳性表达。所有35例PSH中两种细胞均未见以上标记物的阳性表达,Notch3和Notch4在多角形细胞的表达远高于表面立方细胞的表达(P＜0.05)。2、Axin及C-myc的表达情况35例PSH中Axin主要在立方型细胞中呈阳性表达,多角形细胞仅见少数细胞呈阳性表达。而C-myc在多角形细胞中的表达明显强于立方细胞的表达(P＜0.05)。3、E-cadherin、β-catenin的表达情况35例PSH的两种细胞均呈TTF-1强阳性表达,表面立方细胞中,E-cadherin、β-catenin均呈胞膜强阳性表达,β-catenin在胞膜阳性表达的同时伴有部分胞浆表达。而在多角形细胞中,E-cadherin胞膜不表达或弱阳性表达；β-catenin胞膜大部分表达缺失伴部分胞浆表达4、其他标记的表达情况间质细胞标记Vimentin主要在多角形细胞中表达,少量在表面细胞中阳性表达。而在两种细胞中我们均能看到生长因子TGF-β1, IGF-1,以及MMP2以及MMP9的表达,只是立方细胞表达相对较弱。二、PCR结果1、通过PCR我们仍然未有检查出Stro-1及Nestin的表达,Sca-1, ABCG2及OCT4的表达较弱未见明显差异。2、E-cadherin mRNA的在立方细胞中表达高于多角形细胞(P＜0.05)。3、Notch3, Jagged1, C-myc, Twist, Snai的mRNA的表达在多角细胞中表达明显增多于立方形细胞(P＜0.05)。结论1.两种细胞均来自于肺泡上皮细胞,多角形细胞分化具有不成熟性,具有相对较高的增殖活性。2. PSH特殊结构的形成可能与上皮间质转化有关。3.多角形细胞的形成可能是上皮细胞间质转化的结果。