论文部分内容阅读
Orexin和CART (cocaine-and amphetamine-regulated transcript)都是下丘脑神经肽,均为重要的摄食调控因子。其中orexin为促食欲因子,刺激食欲促进摄食；CART为厌食因子,抑制食欲减少摄食。本研究以南方鲇(Silurus meridionalis Chen)为研究对象,采用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到了orexin cDNA和CART cDHA全长序列,并对其编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析；采用荧光定量PCR研究了南方鲇幼负的脑、肝脏、肾脏、心脏、胃、肠和鳃等7种组织中orexin mRNA和CART mRNA的表达分布；研究了受精卵、囊胚期、原肠胚期、神经胚期和出膜后第一次摄食前等5个早期发育阶段中orexin mRNA和CARTmRNA的表达情况；研究了摄食前2h、摄食前0h、摄食后2h、饥饿24h、饥饿48h、饥饿1周和饥饿2周等各时间点幼鱼脑组织中orexin mRNA和CARTmRNA的表达情况。本研究所取得主要的结果如下：1、Orexin基因cDNA序列全长707bp,其中开放阅读框为474bp,编码158个氨基酸,由38个氨基酸的信号肽、48个氨基酸的orexin-A、28个氨基酸的orexin-B、38个C端未知功能的多肽和两个GKR蛋白水解位点组成。CART基因cDNA序列全长688bp,其中开放阅读框为357bp,编码118个氨基酸,信号肽为25个氨基酸。2、Orexin蛋白分子量为17.45KD,等电点为9.67,不稳定系数为38.01,总平均亲水性为-0.382；该蛋白由19种氨基酸组成,其中亮氨酸含量最高,占15.80%,苯丙氨酸含量最低,占0.60%。CART蛋白分子量为13.33KD,等电点为8.18,不稳定系数为39.10,总平均亲水性为-0.147；该蛋自由20种氨基酸组成,其中亮氨酸含量最高,占14.41%,组氨酸、色氨酸和酪氨酸含量最低,各占0.85%。两者二级结构均由α-螺旋、无规卷曲、p-折叠和延伸链组成。3、南方鲇orexin-A与斑马鱼、金鱼、石斑鱼、比目鱼、大西洋鳕和人的orexin-A序列相似性分别为56.3%、50.0%、47.9%、45.8%、33.3%和37.5%；orexin-B与斑马鱼、金鱼、石斑鱼、比目鱼、大西洋鳕和人的orexin-B序列相似性分别为75.0%、75.0%、60.7%、64.3%、55.2%、50.0%；分子进化树显示,南方鲇orexin与金鱼和斑马鱼聚为一支。南方鲇CART与斑点叉尾鮰、金鱼CART1、金鱼CART2、鲤鱼CART1、鲤鱼CART2、大西洋鳕、比目鱼、大西洋鲑、东鳐鱼和人类的CART序列相似性依次为95.8%、72.0%、75.0%、72.9%、75.0%、72.0%、61.9%、69.5%、48.3%和52.5%,分子进化树显示,南方鲇CART与斑点叉尾鮰聚为一支。4、脑中orexin mRNA和CART mRNA的表达量显著高于肝脏、肾脏、心脏、胃、肠和鳃等6种外周组织,肾脏和心脏的orexin mRNA表达量显著高于其他外周组织,其他组织间差异不显著；CART mRNA在外周组织间差异不显著。5、受精卵中没有检测到orexin和CARTmRNA,囊胚期、原肠胚期、神经胚期和出膜后第一次摄食前均检测到orexin mRNA和CART mRNA,且随发育进行orexin和CART mRNA的表达量呈现上升趋势。6、正常摄食条件下,orexin mRNA在摄食前0h时表达量显著高于摄食前后,而CART mRNA在摄食前0h时表达量显著低于摄食后。饥饿条件下,48h饥饿orexin mRNA表达量上调,1周和2周饥饿orexin mRNA和CART mRNA表达量都下调。经讨论得出以下结论：1、分子进化树表明,南方鲇orexin与金鱼和斑马鱼亲缘关系较近；南方鲇CART与斑点叉尾鮰亲缘关系较近。2、Orexin mRNA和CART mRNA在脑中表达量最高,与其功能相吻合,两者都是下丘脑神经肽,都具有调节摄食的作用。与已有研究比较发现,orexin mRNA和CART mRNA在外周组织中表达存在种间差异。3、胚胎发育阶段较早时期就已检测到orexin mRNA和CART mRNA,且随发育进行表达逐渐升高,神经系统和器官形成于神经胚期和器官分化阶段,表明基因表达早于神经系统形成；胚胎阶段主要能源物质为卵黄,随发育进行卵黄消耗殆尽,机体需从外界摄取食物,同时又要防止外界食物匮乏以及食物中存在有毒物质,使有毒物质过快进入体内,故orexin mRNA和CART mRNA均逐渐升高。4、摄食前0h机体胃中食物将要消耗殆尽,饥饿感逐渐上升,orexin mRNA表达量增高,CART mRNA表达量降低；摄食后胃中食物饱满,饱足感强烈,orexin mRNA表达量降低,CART mRNA表达量升高；短期饥饿机体主动增加orexin mRNA表达量使机体保持待摄食状态,以获取更多食物提供生长所需能量,属于主动调节；长期饥饿时机体为了抵抗外界不良环境而使机体各个系统机能调低,进而降低食欲,orexin mRNA和CART mRNA表达量均降低,属于被动调节,推测orexin和CART基因可能协调调控南方鲇的摄食。