白斑综合症是危害世界虾养殖业的一大危害,自1992年在中国台湾发现以来,随后迅速在亚洲、欧洲、美洲蔓延开来。一旦感染白斑综合症病毒(WSSV),对虾3-10天发病,且死亡率100%,至今仍没有针对WSSV有效治疗方法。目前只能以清洁养殖环境、筛选抗病毒虾苗、使用一般的抗病毒药等手段预防WSSV感染。自WSSV基因组测序工作完成以来,越来越多的研究重点放在WSSV感染宿主细胞致病机理上,并且已经证明病毒囊膜蛋白在感染宿主的过程中起到了关键性作用,其中囊膜蛋白VP28研究居多。VP28蛋白已经在多种真核、原核表达系统中表达并被证明能够有效的抵御WSSV感染,所以重组VP28蛋白疫苗可作为防治白斑综合症的一种新手段。大肠杆菌中表达的VP28蛋白需要提取纯化后才能施用,这会增加成本和技术难度,对于规模化养殖中应用推广是十分不利的。蓝藻为光合自养生物,结构简单,基因组小便于遗传操作,蛋白酶含量少不易分解外源表达产物,光合效率高,生长速度快,且个体为多细胞易于大量收获。因此,蓝藻作为原核表达系统已被广泛应用于制备重组药物、生物柴油和环境保护等领域。对虾仔虾期具有植食性阶段,蓝藻为天然开口饵料,故蓝藻可作为口服重组疫苗。本实验室目前已获得转vp28基因的鱼腥藻7120(丝状体蓝藻),并经过药效试验证明其具有抗WSSV能力。但是关于其VP28蛋白的表达效率、表达规律以及投喂对虾防治WSSV的有效剂量却知之甚少。所以,本文构建了一种定量检测鱼腥藻7120异源表达VP28蛋白的方法,以解决上述问题。1.vp28基因原核表达载体构建与表达及纯化首先将密码子优化后合成的vp28基因序列,通过PCR扩增技术克隆获得目的片断产物,然后与pET-28a表达载体连接,构建大肠杆菌高效表达载体pET-28a-vp28。采用热激法转化DH5α,应用抗生素筛选阳性克隆,再经PCR鉴定(636bp)正确后,提取其质粒进行双酶切,结果验证后(重组质粒5910bp,双酶切产物5289bp、621bp)再进行DNA测序验证。测序结果表明,vp28基因正确的插入到了pET-28a表达载体中,最终成功获得了重组pET-28a-vp28表达载体。将其转入表达菌株bl21(de3)中后,卡那霉素筛选出阳性克隆,并用iptg进行诱导表达,sds-page电泳结果显示vp28蛋白诱导表达成功。进一步确定诱导表达的vp28蛋白是包涵体。包涵体经尿素洗涤并溶解后,利用biologiclp层析系统过镍柱琼脂糖亲和层析纯化,经含有10-250mm梯度浓度的咪唑洗脱后,得到融合蛋白,结果显示纯化蛋白为单一条带分子量约为30kda,纯度为95%以上。使用非干扰型蛋白浓度测定试剂盒测定纯化后的重组蛋白浓度为1.094mg/ml。2.抗vp28单克隆抗体的制备使用软件分析vp28氨基酸序列,综合其二级结构、跨膜区、信号肽、抗原性等参数选取了8个表位合成多肽并偶联血蓝蛋白klh,制备免疫原。常规方法免疫小鼠,选取抗血清效价1:16000的balb/c鼠1的脾细胞与杂交瘤细胞进行融合,有限稀释法筛选阳性克隆,得到3株单克隆细胞株,分别为e9、a7和h3。制备腹水后,elisa法测定其亚型均igg,效价分别为1×10-6、1×10-5、1×10-4,表位分别为ngksdaqmkeed(84-95aa)、dnietnmdenlr(42-53aa)、ssftpvsidede(156-167aa)。选取效价最高的e9作为后续westernblotting实验的第一抗体。3.工程蓝藻vp28外源蛋白表达量的定量检测将野生型和转vp28基因鱼腥藻7120分别进行单藻落纯化并扩大培养,并进一步采用逐渐增加硫酸新霉素浓度(25-200μg/ml)方法筛选出含有重组质粒的转基因鱼腥藻7120。将筛选后的工程藻株培养在200μg/ml硫酸新霉素液体培养基中,并分别提取转基因鱼腥藻7120和野生型的蛋白,应用单克隆抗体e9进行westernblotting定性检测和验证。将该2种藻株分别以1:50比例重新接种,设三个平行样,培养在30℃培养箱内。然后分别采集接种后第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23天的藻液,一方面使用分光光度计测定其od750值,绘制藻体生长曲线。一方面采用冻融法破碎细胞并提取各自的总蛋白,bradford法测定总蛋白浓度后,-80℃保存。采用效价为1:10000的抗vp28单克隆抗体e9作为第一抗体,1:5000hrp标记的羊抗鼠igg作为第二抗体进行westernblotting。将已纯化的原核表达pet-28a-vp28融合蛋白依次上样0.05μg、0.1μg、0.25μg、0.5μg、1μg、2μg作为横坐标,chemi-docmpimagingsystem成像仪采集条带的信号累计强度作为纵坐标,制作定量westernblotting标准曲线,采用r2大于0.99的标准曲线计算出转基因鱼腥藻7120中vp28的表达量。结果显示,转基因鱼腥藻7120产出的vp28量是先高后低,其中培养第17天时,vp28表达量达到最高,为5.14μg/ml,占总蛋白浓度的1.45%,而第15天总蛋白浓度最大,可见vp28蛋白表达量和总蛋白并不是协同增长的。野生型和转基因鱼腥藻7120的生长曲线基本相似,均是在第21天达到最大生长量,并且转基因鱼腥藻7120的生长速率为野生型的95.30%。可见藻体生长量最大的时间与VP28表达最大量是不同步的。