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高温可使植物体内水分流失、活性氧积累、光合作用受阻,显著影响植物生长发育和作物产品质量,长期高温甚至导致植株死亡。猕猴桃产业是乡村振兴的重要助推力量,然而猕猴桃作为多年生果树,其生长易遭遇高温胁迫。解析植物响应高温胁迫机制,是耐高温优良品种培育工作的基础。短暂高温胁迫可诱导大量基因的表达变化,其中以热激转录因子Hsfs及其靶标热激蛋白Hsps最为显著,筛选鉴定高温胁迫响应的关键成员并解析其作用机制,可为猕猴桃精准育种工作提供可靠的靶标。本研究以中华猕猴桃‘东红’（Actinidia chinensis cv.Donghong）为试材,结合转录组、猕猴桃遗传转化以及RT-q PCR、双荧光素酶等分子生物学技术,鉴别响应高温的关键基因,主要内容如下:1.观察测定‘东红’响应高温胁迫的生理表型及生化指标。高温模拟实验发现,极端高温50℃处理时间越长,植株热损伤程度越高、恢复能力越低:与20℃培养的对照植株相比,50℃处理1 h、2 h、4 h和6 h后植株叶片含水率显著下降;叶片H2O2含量在50℃处理1 h内上升,处理2 h及更长的时间后变化不显著。高温处理1 h时植株叶片轻微萎蔫,随着培养温度降至20℃能够逐渐恢复;处理2 h或更长时间,叶片失水萎蔫、枯黄脱落,即使培养温度降至20℃仍无法恢复,并随着处理时间的延长伤害加剧。这与叶绿素含量在50℃处理至少2 h后才显著下降的结果相符。2.筛选响应高温胁迫的候选基因。研究以正常培养的植株叶片（CK）、50℃分别处理2 h（HT2）和4 h（HT4）的植株叶片为试材构建的转录组数据库。相较于CK,HT2中有209个差异表达基因（DEGs）响应高温胁迫,其中146个上调、63个下调;HT4中有1776个DEGs,包括469个上调、1307下调。为挖掘响应高温胁迫的核心基因,基于FDR≤0.01、log2|Fold Change|≥6、最大FPKM≥5的标准从DEGs中筛选出40个在HT2和HT4中均差异表达的热激强响应基因（HHGs）。HHGs主要与转录后修饰、蛋白周转和分子伴侣相关,包括2个热激响应转录因子AcHsf A2-1（Acc28668）和AcHsf A7a（Acc25577）、3个热激响应最强烈的热激蛋白编码基因AcHsp20-1（Acc16656）、AcHsp20-2（Acc25875）和AcHsp20-3（Acc11386）。3.分析高温胁迫过程中AcHsfs对AcHsp20的转录调控机制。亚细胞定位分析显示,AcHsf A2-1和AcHsf A7a蛋白均定位于细胞核。利用烟草双荧光素酶系统分析AcHsfs对AcHsp20-1、AcHsp20-2和AcHsp20-3启动子的调控效应,结果显示:AcHsf A2-1对3个AcHsp20启动子的活性均有诱导效应,激活倍数分别约为70、160和50倍;AcHsf A7a激活AcHsp20-1、AcHsp20-2和AcHsp20-3启动子的倍数分别约为200、70和20倍。4.鉴定AcHsfs响应高温胁迫的功能。利用猕猴桃遗传转化体系,分别获得过量表达AcHsf A2-1的OX-AcHsf A2-1（Line 2和7）和AcHsf A7a的OX-AcHsf A7a（Line 2和4）的阳性株系（OX-AcHsf A7a植株较小,未进行表型鉴定）。基因表达结果显示,OX-AcHsf A2-1和OX-AcHsf A7a的所有株系中AcHsp20-1、AcHsp20-2和AcHsp20-3的表达均上调,与双荧光素酶的结果一致。相较于未转化的野生型猕猴桃植株,OX-AcHsf A2-1对50℃2 h高温处理的耐受性显著增强。5.构建AcHsf A2-1参与高温胁迫响应的转录调控网络。研究构建了OX-AcHsf A2-1转录组数据库,筛选出69个在Line 2和7中均差异表达的基因,其中50个上调、19个下调,且34个DEGs在50℃处理的野生型植株转录组中也差异表达,其中包括AcHsf A2-1、AcHsp20-1、AcHsp20-2和AcHsp20-3。进而鉴定了AcHsf A2-1对其他4个Hsp和8个非Hsp基因启动子转录活性的调控效应,结果显示:除3个Hsp20外,AcHsf A2-1对其它3个Hsp基因（AcDJ1、AcCB1和AcDJ2）和3个非Hsp基因（AcE3、AcEGY3和AcMIT）均有正调控效应。综上,本研究基于转录组数据分析、转录调控验证实验和猕猴桃转基因技术,鉴定了基于AcHsf A2-1的猕猴桃高温胁迫响应机制,为精准培育耐高温品种提供了靶标。