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目的:探究黄花倒水莲(PH)活性成分的类雌激素样表现以及对子宫内膜癌(Hec-1-B)细胞的抑制作用,为其发挥两种药理活性提供科学依据。 方法:(1)采用乙醇提取,大孔树脂纯化的方法提取黄花倒水莲总黄酮(PHF)和总皂苷(PHS);用石油醚脱脂、乙醇脱酚和色素,水提醇沉法以及Sevag法除蛋白提取黄花倒水莲粗多糖(PHP)。利用比色法分别测定各组分含量。 (2)采用DEAE-52纤维素和葡聚糖凝胶G-100(Sephadex G-100)作为柱色谱填充材料,对多糖进行分离纯化。多糖上DEAE-52纤维素柱后以纯水、0.1mol·L-1NaCl、0.5mol·L-1NaCl、1mol·L-1NaCl冲洗,分别收集不同组分,用透析袋透析出去盐,得到PHP1、PHP2、PHP3、PHP4,待筛选最佳部位后用存水过凝胶柱,同时采用硫酸蒽酮法进行多糖含量的测定。 (3)采用体外细胞学方法,CCK-8法,体外培养Hec-1-B子宫内膜癌细胞,以戊酸雌二醇(雌激素)为对照,对黄花倒水莲不同部位进行观察,比较其与戊酸雌二醇表达类似作用效益,探索其类雌激素样表现,并筛选其抑制子宫内膜癌细胞活性的部位。 (4)采用70%乙醇提取,大孔树脂柱色谱、聚酰胺柱色谱、硅胶柱色谱、ODS柱、Sephadex LH-20柱色谱、重结晶等分离方法对总黄酮部位进行分离纯化得到单一化合物,通过理化检验、EI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT等波谱方法和文献数据进行化合物结构鉴定。 (5)采用SPSS22.0统计软件、GraphPad.Prism.v5.0.作图软件以及Excel表格进行数据的处理和图表的制备,并计算细胞增值率和细胞抑制率。 结果:(1)提取得到不同部位产量分别为:总黄酮PHF(35.5g/kg)、总皂苷PHS(33.5g/kg)、PHP总多糖(20g/kg)。硝酸铝显色法测得PHF的含量为68.72%、香草醛比色法测得PHS的含量为65.00%,硫酸蒽酮比色法测得PHP的含量为72.43%。 (2)体外细胞实验验证活性结果为,PHF、PHS能够抑制Hec-1-B细胞的生长,PHF在0.5g·L-1、1g·L-1、2g·L-1时有显著性差异(p<0.05或p<0.01),PHS在0.5g·L-1、1g·L-1、2g·L-1时有显著性差异(p<0.05或p<0.01);而PHP对Hec-1-B细胞呈现促进生长作用,在0.03125g·L-1-2g·L-1浓度范围内均具有促进作用。 (3)通过对比戊酸雌二醇对Hec-1-B的作用得出,PHP和雌激素具有相同的作用趋势,在0.03125g·L-1-2g·L-1浓度范围内无统计学意义,说明PHP发挥类雌激素样作用,筛选纤维素柱分级的不同流分PHP1、PHP2、PHP3、PHP4得最佳部位为PHP3。经葡聚糖凝胶柱纯化后硫酸蒽酮法测得PHP3含量为93.38%。 (4)PHP3红外谱图显示,PHP3为β构型多糖,有磷酸基和吡喃糖苷。 (5)黄花倒水莲总黄酮部位分离得到10个化合物,其中黄酮类的化合物5个,分别为1,3-二羟基-2-甲氧基(山)酮(3),5,6,4-三羟基-7,8-二甲基高异黄酮(5),5,7,4-三羟基高异黄酮(7),2,3-metilenodioxixantona(8),2-羟基-3,4-二甲氧基(山)酮(10)。化合物4为羽扇豆醇,皂苷类1个为化合物6远志皂苷和2个脂肪酸分别为化合物1蜡酸和化合物9棕榈油酸。5个黄酮类成分半数抑制率IC50在0.05g·L-1左右,显示有效。其他成分半数抑制率IC50都大于0.5g·L-1,显示无效。 结论:通过对黄花倒水莲不同部位提取和活性筛选,得到产生类雌激素样表现为多糖部位,并且进过纯化的到PHP3为最终的活性成分;产生抗Hec-1-B癌细胞活性的为黄酮部位,且最终经过对黄酮部位的分离纯化,得到10个目标化合物,经过活性筛选,确定其中6个具有活性分别为:1,3-二羟基-2-甲氧基(山)酮(3),5,6,4-三羟基-7,8-二甲基高异黄酮(5),5,7,4-三羟基高异黄酮(7),2,3-metilenodioxixantona(8),2-羟基-3,4-二甲氧基(山)酮(10)。