人胃癌耐药细胞株的建立和新型β-内酰胺类化合物抗肿瘤耐药研究

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第一部分:人胃癌耐紫杉醇细胞株MGC803/PTX的建立及机制研究采用紫杉醇浓度梯度递增法诱导人胃癌MGC803细胞建立耐药细胞株MGC803/PTX,探讨人胃癌耐药细胞MGC803/PTX与亲本细胞MGC803之间的差异。方法:用紫杉醇以浓度梯度递增诱导法构建人胃癌耐药细胞株MGC803/PTX;倒置显微镜下观察紫杉醇诱导过程中细胞形态学变化;CCK8法检测MGC803/PTX细胞株的耐药指数及其稳定性;CCK8法检测MGC803/PTX细胞株对5-FU和ADR的耐药性;细胞计数法绘制MGC803和MGC803/PTX细胞株的生长曲线;克隆形成实验测定MGC803和MGC803/PTX细胞株的克隆形成率;荧光显微镜下观察紫杉醇作用后细胞和细胞核形态学变化;流式细胞仪分析细胞凋亡和周期分布情况。Western blot实验检测耐药细胞株与亲本细胞株中P-gp、Bcl-2、Bax、PARP、β-catenin、p-GSK-3β等蛋白的表达,比较两株细胞蛋白表达的差异,分析MGC803/PTX细胞株可能的耐药机制。结果:历时10个月成功构建了人胃癌耐药细胞株MGC803/PTX,对紫杉醇的耐药指数为9.3,诱导过程中细胞由长梭形逐步变成短多边形,体积变小,诱导结束后3个月内紫杉醇对MGC803/PTX细胞IC50变化不大。MGC803/PTX对5-FU和ADR这两种化疗药物存在一定的交叉耐药性,RI分别为4.38和1.4;耐药细胞MGC803/PTX的生长速度比亲本细胞MGC803慢,群体倍增时间延长,分别为24.55h和22.5h;MGC803和MGC803/PTX细胞克隆形成率有明显差异(p<0.001),耐药细胞MGC803/PTX克隆形成能力明显高于亲本细胞MGC803;PTX作用两株细胞,Hoechst 33258染色后细胞核的染色增强,细胞核染色质浓缩且有凋亡小体生成,但MGC803/PTX细胞凋亡率明显低于MGC803细胞;流式细胞仪检测结果同样显示耐药细胞株MGC803/PTX凋亡率低于MGC803细胞,20nMPTX作用后凋亡率分别为1.8%和24.2%。MGC803/PTX细胞周期分布中G0/G1期占71.95%、S期占14.8%、G2期占10.15%,亲本细胞MGC803中G1期占62.4%、S期占11.275%、G2期占20.47%,耐药株中G0/G1期明显增多。耐药细胞株MGC803/PTX与亲本细胞相比,P-gp、Bcl-2、PARP蛋白表达上调,Bax、β-catenin和p-GSK-3β蛋白的表达下调。结论:1首次成功建立了稳定的人胃癌耐药细胞株MGC803/PTX;2耐药细胞株MGC803/PTX的生物学特性包括细胞形态,细胞增殖率,细胞凋亡率,周期分布等均发生明显变化;3与亲本细胞MGC803比较,P-gp明显上调,抗凋亡蛋白Bax明显下调,同时促凋亡蛋白Bcl-2,PARP等也有一定程度的上调,这是其耐药的部分原因。同时耐药细胞MGC803/PTX中,β-catenin和p-GSK-3β蛋白的表达与MGC803细胞比较也有差异,说明其耐药机制与Wnt/β-catenin相关通路有关。第二部分:化合物20对MGC803/PTX的作用研究探讨新型化合物20对耐药细胞株MGC803/PTX的作用,以及初步的机制研究。方法:CCK8法检测不同作用时间化合物20对MGC803/PTX的抗肿瘤活性;克隆形成实验检测化合物20对单个细胞增殖的作用;Hoechst 33258染色法观察化合物20作用后MGC803/PTX细胞核形态变化;高内涵分析技术结合PI染色法检测化合物20对耐药细胞周期阻滞作用;Western blot检测化合物20作用后P-gp、Bcl-2、Bax、Pro-PARP1、Cleaved caspase-3等蛋白的表达情况。结果:CCK8实验结果表明化合物20对MGC803和MGC803/PTX细胞均有很好的活性;化合物20作用后MGC803/PTX细胞出现明显的染色质皱缩,核碎裂等细胞凋亡形态;化合物20作用后MGC803/PTX细胞周期分布发生变化,G2/M期占的比例明显增多;化合物20作用后P-gp、Bcl-2、Pro-PARP1蛋白下调,Bax,Cleaved caspase-3上调。结论:1化合物20对MGC803/PTX细胞有很强的增殖抑制作用2化合物20能将MGC803/PTX细胞阻滞在G2/M期3化合物20的作用机制与细胞线粒体凋亡通路有关,能上调Bax、Cleaved caspase-3等促凋亡蛋白,下调Bcl-2、Pro-PARP1蛋白的表达,同时化合物20还能下调P-gp,从而导致MGC803/PTX细胞凋亡。4新型β-内酰胺类化合物20对肿瘤耐药细胞MGC803/PTX作用明显,可以考虑下一步开发相关制剂,深入研究其机制。
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