【摘 要】
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目的:克隆人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)的编码框,构建携带BDNF基因的重组质粒pEGFP-BDNF。为进一步基因治疗感音神经性聋奠定基础
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目的:克隆人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)的编码框,构建携带BDNF基因的重组质粒pEGFP-BDNF。为进一步基因治疗感音神经性聋奠定基础。方法:(1)克隆人BDNF cDNA:选用培养符合标准的Hale细胞,利用Trizol试剂提取总RNA;RT-PCR扩增人BDNF cDNA片段;克隆到pMD18-T Vector载体。(2)pEGFP-BDNF的构建和鉴定:分别在上下游引物中引入XhoI,BAMHI酶切位点,再次克隆到pMD18-T中,转化大肠杆菌,筛选阳性重组子。BDNF与pEGFP-N2载体经XhoI,BAMH I双酶切,T4 DNA连接酶连接,DNA测序鉴定插入片段与开放读码框的正确性。(3)细胞转染:利用脂质体法将重组质粒pEGFP-BDNF转染Hale细胞。(4)检测融合蛋白pEGFP-BDNF的表达:利用荧光显微镜观察转染细胞中绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测转染细胞中BDNF的表达。结果:克隆人BDNF cDNA,成功构建了重组质粒pEGFP-BDNF,转染Hale细胞48小时后,荧光显微镜观察转染细胞中有绿色荧光,Western blot检测进一步证明构建的pEGFP-BDNF能在Hale细胞中表达目的基因BDNF蛋白。结论:成功构建表达重组质粒pEGFP-BDNF,为研究BDNF在体内外转基因治疗内耳疾病,感音神经性耳聋奠定了一定基础。
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