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背景肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全世界最严重的健康问题之一。在最常见的恶性肿瘤中,HCC的发病率在男性和女性中分别为第六位和第九位。近几年HCC的发病率却一直在增加。其中主要原因是HCC的早期症状不明显,病情进展快,确诊时多数已进展至中晚期,已发生了远处的扩散和转移。临床的挑战是能够提前识别患者转移的潜能,从而选择更为合适的治疗方案。因此,探讨HCC的病因、发病机制,深入了解参与HCC复发、转移和转移的相关分子机制,寻找新的诊断标志物具有重大的临床意义,并为发展新的治疗策略提供有力的理论依据。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞在胚胎发生及病理状态下,转化为具有间充质特点的间叶样细胞的现象,在胚胎发育中起着关键的作用。越来越多的证据表明：在肿瘤中,EMT是促进细胞迁移、肿瘤侵袭和转移的关键步骤。而包括TWIST在内的多个转录因子在EMT的调节中所起的作用至关重要。研究表明,TWIST作为EMT的关键调控因子,对肿瘤的侵袭和转移有重要作用。EMT通常发生在肿瘤的侵袭前沿(肿瘤-基质边界),由来自微环境中的细胞信号启动,而浸润炎性细胞是肿瘤微环境中对EMT起作用的主要因素。包括巨噬细胞在内的所有的浸润炎性细胞能够产生多种生长因子和细胞因子,并可通过多种机制促进肿瘤的血管生成、细胞外基质降解、侵袭和转移。TNF-α是重要的炎性细胞因子,在肿瘤进展中发挥重要作用。肿瘤微环境中TNF-α的组成性表达是许多恶性肿瘤的共同特征,其表达与肿瘤患者的预后不良密切相关。本研究拟探讨TWIST蛋白在炎症因子TNF-α介导的肝癌细胞的迁移、侵袭、转移中的作用。这将为我们深入理解炎症微环境促进肿瘤进展及转移的分子机制,完善对肿瘤生物学的认识和发展新的肿瘤治疗干预手段提供实验依据。目的探讨TWIST蛋白在炎症因子TNF-α介导的肝癌细胞的迁移、侵袭、转移中的作用,为我们深入理解炎症微环境促进肿瘤进展及转移的分子机制,完善对肿瘤生物学的认识和发展新的肿瘤治疗干预手段提供理论基础和实验依据。方法1.采用荧光定量PCR (qRT-PCR)方法检测和GeNorm、 NormFinder、BestKeeper软件分析在TNF-α作用下,肝癌细胞中稳定表达的内参基因,以推荐在细胞因子TNF-α处理肝癌细胞这个特定的实验条件下对实验数据进行标准化的内参基因。2.通过Western blotting方法检测肝癌细胞BEL-7402在不同浓度及时间点TNF-a作用后TWIST蛋白表达水平的差异；利用qRT-PCR检测10ng/mlTNF-α作用后不同时间点TWIST mRNA的变化；利用Transwell侵袭和迁移试验检测TNF-α对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响；通过Western blotting方法检测TNF-α对肝癌细胞EMT的影响；研究TNF-α对肝癌细胞BEL-7402TWIST蛋白的表达、侵袭转移及EMT的影响。3.运用Western blotting方法检测TNF-α影响肝癌细胞BEL-7402中TWIST蛋白表达的信号转导通路；利用针对NF-кB的RelA-siRNA特异性的干扰其作用,Western blotting方法检测干扰后TWIST蛋白的表达；以确定TNF-α是否通过NF-кB信号通路调控TWIST的表达。4.构建针对TWIST的RNAi质粒(pGPU6-TWIST-782. pGPU6-TWIST-812)和阴性对照质粒(pGPU6-Scrambled)并转染具有侵袭能力的人肝癌细胞系BEL-7402细胞,采用Western blotting和qRT-PCR检测TWIST的抑制效率,选择TWIST抑制效率最高的经G418筛选得到稳定TWIST表达抑制的肝癌细胞模型pGPU6-TWIST (si-TWIST)。采用Western blotting检测转染组pGPU6-TWIST (si-TWIST)、对照组pGPU6-Scrambled (si-Scrambled)及BEL-7402未转染组三组细胞中EMT相关蛋白(E-cadherin、vimentin)的表达；采用Transwell侵袭和迁移试验检测转染组pGPU6-TWIST (si-TWIST)、对照组pGPU6-Scrambled (si-Scrambled)及BEL-7402未转染组三组细胞侵袭迁移能力的影响,以证实转录因子TWIST是TNF-α能够促进肝癌细胞发生EMT和侵袭迁移的关键分子。5.动物实验研究：采用细胞悬液接种法,将pGPU6-TWIST和BEL-7402细胞种植于裸鼠皮下及腹腔内,建立裸鼠肝癌细胞移植瘤和转移瘤模型。裸鼠分为4组,分别为：皮下BEL-7402组、皮下pGPU6-TWIST组、腹腔BEL-7402组、腹腔pGPU6-TWIST组。分别于皮下及腹腔给予TNF-α,隔日腹腔注射,定期观察裸鼠及肿瘤生长情况,测量肿瘤的长径(a)、短径(b),按公式V=ab2/2计算肿瘤的近似体积,38天后处死裸鼠,病理观察肿瘤的生长、浸润及转移情况,在体内进一步证实转录因子TWIST是TNF-α能够促进肝癌细胞发生EMT和侵袭迁移的关键分子。结果1.经GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件分析在细胞因子TNF-α处理肝癌细胞特定的实验条件下,TBP可以作为对实验数据进行标准化的内参基因。2. TWIST蛋白的表达与TNF-α呈现出剂量和时间的依赖性。而在10ng/ml的TNF-α作用不同的时间后,BEL-7402细胞中TWIST的mRNA的表达并没有明显的改变。TNF-α促进肝癌细胞侵袭和迁移及EMT的发生。3. TNF-α通过调节NF-кB信号转导通路进而诱导人肝癌细胞TWIST蛋白的表达。4. si-TWIST抑制TNF-α诱导的肝癌细胞侵袭迁移能力和EMT的发生。5.裸鼠成瘤结果显示：皮下pGPU6-TWIST组在肿瘤生长速度、体积均明显低于皮下BEL-7402组；腹腔pGPU6-TWIST组在肿瘤播散及腹水形成也均明显低于腹腔BEL-7402组。结论1.在特定的实验条件下对候选的内参基因进行筛选是非常必要的。本实验我们推荐TBP作为内参基因对实验数据进行标准化。我们的实验结果也为那些有兴趣研究不同的细胞因子在不同的肿瘤中所起的作用的研究人员提供了理论基础。2.炎症细胞因子TNF-α可能通过依赖NF-кB信号转导通路激活转录因子TWIST从而促进肝癌细胞发生EMT和侵袭迁移。图41幅,表8个,参考文献84篇