膀胱移行细胞癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,发病率居高不下,临床上主要以手术、放化疗和免疫治疗为主,虽能明显的延长患者的生存期,但因其具有多发和易复发的特点,远期疗效及患者生活质量并不令人满意,尤其是中、晚期患者,往往丧失了手术机会。作为一种有望彻底治愈肿瘤的治疗方式,肿瘤基因治疗虽然开展较晚,却拥有广阔的前景。近年来,伴随分子生物学、细胞生物学的发展及各种癌基因、抑癌基因的发现,肿瘤基因治疗获得了极大进步,并取得了可喜的成绩。肿瘤基因治疗的关键是靶向性杀伤,既要有效杀伤肿瘤细胞,又不能杀伤或干扰正常细胞。缺乏肿瘤细胞靶向性是限制基因治疗不能广泛应用于临床的瓶颈。具有特异性肿瘤杀伤作用的基因是肿瘤基因治疗的理想选择。Apoptin是由鸡贫血病毒VP3基因编码的凋亡功能蛋白,包含21个氨基酸,分子量为13.6KD,不与任何已知蛋白同源。研究表明,Apoptin具有广谱的诱导肿瘤细胞凋亡效应,能诱导卵巢癌、肝癌、恶性淋巴瘤等多种肿瘤细胞凋亡,而对正常淋巴、真皮、上皮、内皮等人正常和原代二倍体细胞无杀伤及毒性作用,尤其是对化疗药物及放射治疗极为敏感的二倍体细胞,如骨髓来源的造血干细胞CD34+和间叶干细胞及淋巴细胞等,均不受Apoptin诱导的凋亡影响,不同途径给药亦未发现Apoptin的毒性效应,这均说明其具有潜在的抗肿瘤应用价值。因此,本研究将此外源性基因引入膀胱癌的基因治疗,构建能表达Apoptin的真核表达质粒,以EGFP为报告基因,脂质体介导瞬时转染膀胱移行细胞癌T24细胞,从体外培养和移植瘤模型两方面研究Apoptin对膀胱癌的治疗作用,并对其与化疗药物顺铂的联合应用可行性做初步探讨。研究目的1.探讨Apoptin对体外培养的T24细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响。2.探讨Apoptin对人膀胱癌裸鼠移植瘤的治疗作用。3.探讨Apoptin与化疗药物顺铂对T24的协同杀伤作用。研究内容和方法1. EGFP标记的Apoptin真核表达质粒的构建及鉴定:以变异型Apoptin质粒p3×flag-m-Apoptin-myc为模板,根据NCBI GenBank登录的野生型Apoptin基因序列设计引物,矫正变异碱基,扩增出野生型Apoptin基因片断,并将其定向克隆于以EGFP作为报告基因的载体pEGFP-N1中,构建能表达Apoptin-EGFP融合蛋白的重组质粒pApoptin-EGFP,重组质粒经双酶切、电泳初步确认,送上海生工测序鉴定。2. Apoptin对膀胱癌T24细胞的诱导凋亡作用:脂质体介导,将重组质粒瞬时转染膀胱癌T24细胞,RT-PCR检测Apoptin mRNA表达,倒置荧光显微镜观察融合蛋白表达,MTT检测转染后不同时相点T24增殖抑制,凋亡光学试剂盒检测转染后T24细胞形态变化和凋亡率,流式细胞仪检测凋亡率和细胞周期。3. Apoptin对膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用:皮下注射T24细胞,建立人膀胱移行细胞癌裸鼠移植瘤模型,于肿瘤直径0.5cm大小时,采用多点注射的方法,将脂质体包裹的质粒pApoptin-EGFP导入T24裸鼠移植瘤,设立空质粒组、生理盐水组作为对照组,观察裸鼠及移植肿瘤生长情况;5周后处死荷瘤鼠,绘制移植瘤生长曲线,计算抑瘤率,肿瘤组织石蜡包埋,常规切片,H.E.染色观察组织细胞形态,TUNEL法检测移植瘤组织细胞调亡。4. Apoptin与顺铂(DDP)对T24细胞的杀伤及协同作用:梯度浓度的顺铂作用于转染pApoptin-EGFP和空质粒的T24细胞,MTT法检测顺铂作用24小时后T24细胞增殖,流式细胞仪检测凋亡,金氏法判断质粒转染与顺铂干预是否具有协同作用。实验结果1.通过酶切电泳及测序鉴定,确认已成功扩增出野生型Apoptin基因,与GenBank登陆序列完全一致,在EcoRⅠ和BamH I酶切位点间正确插入pEGFP-N1载体内,方向及编码序列正确,与EGFP编码序列构成完整阅读框,无移码突变,成功构建理论上能表达Apoptin-EGFP融合蛋白的真核表达质粒pApoptin-EGFP。2.瞬时转染人膀胱癌T24细胞后,RT-PCR检测到Apoptin mRNA表达;荧光显微镜下可见绿色荧光,说明融合蛋白能在真核细胞T24中顺利表达;MTT检测T24细胞增殖情况,结果发现转染apoptin对膀胱移行细胞癌T24细胞生长具有明显抑制作用,24h、48h、72h抑制率分别(19.4±3.76)%,(37.5±4.66)%和(49.5±4.15)%;与空质粒对照组相比,抑制率显著增高。经过凋亡光学试剂盒检测,Apoptin的瞬时转染可引起细胞核高度凝聚,染色质密集、呈边缘化等凋亡特征性表现,经计数,凋亡率约为(21.25±1.98)%,而空质粒组仅为(7.3±1.04)%。流式细胞仪Annexin-V/PI法检测细胞转染率和凋亡,转染后48小时,pApoptin-EGFP组早期调亡率为(18.7±1.13)%, pEGFP-N1组为(4.97±0.57)%,两者具有非常显著差异(P<0.01);晚期调亡细胞Apoptin组为(19.2±1.99)%,较对照组(2.7±1.73)%同样有非常显著的提高,进一步说明Apoptin能显著诱导T24细胞凋亡。流式细胞仪检测24h、48h、72 h三个时相点细胞周期变化,发现瞬时转染空质粒24h可引起S期细胞减少,G1、G2/M期轻度阻滞,随时间推移,以上变化逐渐减弱,72小时基本接近空白对照组,而转染pApoptin-EGFP重组质粒的T24细胞S期细胞比例显著减少,并随时间推移,变化逐渐加大,72小时尤为明显,已由46.8%持续下降到28.5%,G1/G0和G2/M期均有上升,呈现双阻滞现象。3.成功构建人膀胱移行细胞癌裸鼠移植瘤模型;注射pApoptin-EGFP质粒的荷瘤鼠精神状态较好,饮食正常,体重增加,无消瘦等恶病质表现;肿瘤体积小,形态较规则,生长缓慢,处死剥离时与周围组织无明显粘连,净重平均为0.26±0.08g。生理盐水组和空白质粒组荷瘤鼠精神状态差,不喜活动,食欲差,毛色晦暗,消瘦;肿瘤生长速度较快,形态欠规则,处死剥离时与周围组织明显粘连,净重分别为1.02±0.23g和0.83±0.20g。以生理盐水组作对照,pApoptin-EGFP质粒注射组和空质粒组肿瘤抑制率分别为74.5%和18.6%,两者差异明显。三组移植瘤组织切片H.E染色提示三组细胞核大、深染,组织结构紊乱,符合肿瘤细胞特征,pApoptin-EGFP质粒注射组染色质浓缩、聚集的细胞明显增多;TUNEL染色示pApoptin-EGFP、pEGFP-N1、生理盐水三组凋亡率分别为(23.24±6.12)%,(3.52±1.20)%和(1.76±0.44)%,pApoptin-EGFP注射组与空白质粒注射组、生理盐水注射组相比,凋亡率有非常显著差异。说明Apoptin作为外来基因产物对人膀胱癌T24裸鼠移植瘤具有明显的抑瘤作用,治疗期间未见明显的毒、副作用。4.随顺铂(DDP)浓度的增加,DDP、pEGFP-N1+DDP、pApoptin-EGFP+DDP三组T24细胞抑制率逐渐增高;除64ug/ml浓度组外每个剂量点的pApoptin-EGFP + DDP组IR值均比DDP、pEGFP-N1+DDP组为高,差异显著,具统计学意义(P<0.05);64ug/ml组因抑制效应已属平台期,故仅呈增高趋势,却无统计学意义;经计算,DDP、pEGFP-N1+DDP和pApoptin-EGFP+DDP三组的IC50分别为10.61ug/ml,7.9ug/ml和2.4ug/ml;经金氏法计算和分析,确认pApoptin-EGFP质粒转染与DDP干预对T24的抑制增殖效应具有协同作用,而转染空质粒与DDP干预的作用仅为简单相加;同法分析可见pApoptin-EGFP和DDP诱导T24细胞凋亡效应同样具有协同作用,而空质粒与DDP诱导凋亡效应仅为简单相加。结论1.构建了pApoptin-EGFP重组质粒,该质粒能在膀胱癌T24细胞中顺利表达Apoptin-EGFP融合蛋白。2.与空质粒相比,Apoptin能明显的抑制T24细胞增殖,诱导T24细胞凋亡,阻滞细胞周期于G1/G0和G2/M期。3. Apoptin能抑制T24裸鼠移植瘤生长,改善荷瘤鼠一般状态,对膀胱移行细胞癌具有明显的治疗作用,作用方式主要为抑制增殖和促进凋亡,治疗期间未见明显毒副作用。4. Apoptin重组质粒转染联合化疗药物顺铂可加强对T24细胞的抑制增殖效应和诱导凋亡效应,且两种治疗方式具有协同作用;这种协同作用可能与两者均参与对p73家族蛋白的调节有关,其具体机制有待进一步研究。