挥发性麻醉药物已被广泛应用于临床麻醉，但挥发性麻醉药物的作用机制仍是个谜。在163年的研究历史中，有关挥发性麻醉药物的作用机制提出了多种学说，比较著名的有脂溶性学说、蛋白质学说、受体学说和离子通道学说等，但这些学说均不能完整的解释麻醉现象。主要问题在于：一、难以解释挥发性麻醉药物引起的兴奋现象。在临床麻醉中，麻醉医师对挥发性麻醉药物的兴奋性具有深刻的认识。挥发性麻醉药物具有先兴奋后抑制的特点，即麻醉药物的双向作用，但在有关挥发性麻醉药物作用机制的研究中却被忽视。二、难以同时观察到麻醉作用和麻醉药物作用位点。麻醉和麻醉药物作用机制的研究之间存在一个悖论：麻醉和麻醉药物的作用机制不可能同时被观察到。问题的根源在于尚无一种理想的动物模型用于挥发性麻醉药物作用机制的研究。草履虫是具有纤毛的单细胞真核生物，草履虫化学感受的各个方面，信号转导和效应机制都已有阐明，与Ca²⁺/CaM系统有密切关系。我们认为，利用草履虫对化学物质的反应性可以模拟挥发性麻醉药物的麻醉现象。草履虫是单细胞生物，易于进行细胞水平和分子水平的研究，从而探讨全麻作用机制。钙调蛋白（Calmodulin，CaM）是一种能与钙离子结合的蛋白质，普遍存在于真核生物中，是细胞内的一种多功能调节剂，作为细胞内Ca²⁺的受体蛋白，协调细胞的各种依赖Ca²⁺的生物学过程与细胞收缩、胞饮、胞吐、糖元代谢、神经递质合成与释放、细胞分裂、核酸合成、激素合成乃至细胞死亡等有关。由它介导的Ca²⁺功能远比cAMP广泛。Ca²⁺作为第二信使参与各种细胞反应。因此我们假设挥发性麻醉药物可对草履虫的行为学特征产生影响，并通过Ca²⁺/CaM系统发挥效能。本课题首先研究不同浓度的挥发性麻醉药物乙醚、恩氟烷、异氟烷和七氟烷对草履虫行为学的影响，通过观察草履虫对醋酸钠的趋化特性以及运动特征和速率的改变，明确挥发性麻醉药物对草履虫行为学产生影响的浓度及特性，并与异氟烷类似物P485、钙调蛋白抑制剂N-6氨己基-5-氯-1-萘基-磺酰胺（N-（6aminohexyl）-5-chloro-l-naph-thalenesulphonamide，W-7）和卡米达佐（Calmidazoliumchloride，CMZ）以及正戊烷和正癸烷进行对比研究；其次，通过孵育钙荧光染料Fluo-3/AM，分别观察挥发性麻醉药物及其类似物和正烃类物质以及钙调素抑制剂对草履虫胞内钙离子浓度(Intracellular free Ca²⁺ concentration，[Ca²⁺]_i)的影响，探讨挥发性麻醉药物改变草履虫运动特性的作用机制是否与胞内钙离子浓度的变化有关；之后，通过胞内IP₃解笼锁技术模拟挥发性麻醉药物引起胞内钙离子浓度[Ca²⁺]_i的变化，并同时观察草履虫运动特性的改变，从而明确草履虫[Ca²⁺]_i与其运动特性的关系；最后，运用二次谐波发生技术，检测挥发性麻醉药物及其类似物和正烃类物质以及钙调素抑制剂对Ca²⁺-CaM亲和力的影响。结果证实：挥发性麻醉药物乙醚、恩氟烷、异氟烷和七氟烷浓度依赖性的改变草履虫对5 mM醋酸钠的化学趋化性，升高草履虫[Ca²⁺]_i，降低Ca²⁺-CaM的亲和力；钙调蛋白抑制剂W-7和CMZ以及500 mM的具有麻醉作用的正戊烷与以上挥发性麻醉药物一样都对草履虫具有同样的作用，同时也降低Ca²⁺-CaM的亲和力；而不具有麻醉作用的正癸烷发挥的唯一作用是轻度改变草履虫[Ca₂₊]_i，而对其行为学影响甚微，对Ca²⁺-CaM的亲和力无作用。只有相当于1．2 EC50异氟烷浓度，0．37 mM的P485才对草履虫的化学趋化性以及[Ca²⁺]_i有轻微影响，但对Ca²⁺-CaM的亲和力无显著影响。IP₃解笼锁实验证实草履虫的钙离子升高可引起草履虫运动增强，即运动增强与胞内钙离子浓度增加相耦联。提示挥发性麻醉药物可能通过Ca²⁺/CaM系统改变草履虫的运动特性，这一作用机制可阐明挥发性麻醉药物先兴奋后抑制的作用特性，为进一步探索全麻机制提供重要线索。第一部分挥发性麻醉药物及其类似物和正烃类物质以及钙调蛋白抑制剂对草履虫化学趋化性及运动速率的影响目的：观察不同浓度的各种挥发性麻醉药物乙醚、恩氟烷、异氟烷和七氟烷及其类似物P485和正戊烷、正癸烷以及钙调素抑制剂W-7和CMZ对草履虫醋酸钠化学趋化性及运动速率的影响，探讨挥发性麻醉药物作用于草履虫后其行为学的改变及可能的机制。方法：使用T-Maze实验来测试不同浓度各药物对草履虫醋酸钠化学反应性的影响。使用监测软件Image Pro Discovery观察草履虫的动态运动并进行记录。使用运动分析软件Motion Analysis 1．2对视频进行分析，得出草履虫运动速率的改变。结果：（1）化学运动指数。挥发性麻醉药物乙醚、恩氟烷、异氟烷和七氟烷以及钙调蛋白抑制剂W-7和CMZ浓度依赖性的改变草履虫对5 mM醋酸钠的化学趋化性，化学趋化指数(I_che)显著降低。与异氟烷相同浓度的异氟烷类似物P485对这一作用影响不大。具有麻醉作用的正戊烷和具有兴奋作用的正癸烷也可浓度依赖性的降低草履虫醋酸钠的化学趋化指数(I_che)值。（2）运动速率：挥发性麻醉药物和钙调蛋白抑制剂浓度依赖性的一过性增加草履虫的运动速率之后降低到基础水平以下，异氟烷类似物P485引起草履虫短暂的运动速率增加之后逐渐恢复到作用前水平而没有降到基础水平以下。500 mM正戊烷可导致草履虫运动速率短暂升高后逐渐静止，而500 mM的正癸烷草履虫运动产生的作用与挥发性麻醉药物相似。结论：挥发性麻醉药物及钙调蛋白抑制剂浓度依赖性的降低草履虫I_che值，且反应较一致。说明草履虫可作为研究挥发性麻醉药物作用机制的模式生物，挥发性麻醉药物可能通过CaM系统对草履虫的行为学产生影响。第二部分挥发性麻醉药物及其类似物和正烃类物质以及钙调蛋白抑制剂对草履虫胞内钙离子浓度的影响目的：观察不同浓度的各种挥发性麻醉药物乙醚、恩氟烷、异氟烷和七氟烷及其类似物P485和正戊烷、正癸烷以及钙调蛋白抑制剂（W-7，CMZ）对草履虫胞内钙离子浓度的影响，探讨挥发性麻醉药物作用于草履虫后其行为学改变的生理基础。方法：应用激光共聚焦显微镜动态观察分别加入不同浓度挥发性麻醉药物后草履虫胞内钙离子浓度的变化，同时检测异氟烷类似物P485以及正戊烷正癸烷和钙调蛋白抑制剂对草履虫胞内钙离子浓度的影响。结果：0．8 EC₅₀的挥发性麻醉药物对胞内钙离子浓度无显著影响，1 EC₅₀及1．2 EC₅₀浓度的挥发性麻醉药物可浓度依赖性的增加草履虫[Ca²⁺]_i。1μM W-7和CMZ轻度升高草履虫胞内钙离子荧光峰值，但与基础值比较无显著性差异，而高浓度的W-7和CMZ可显著升高草履虫胞内钙离子荧光峰值，[Ca²⁺]_i峰值与基础值的百分比随药物浓度的增加而增加。相同浓度的异氟烷和异氟烷类似物P485对草履虫[Ca²⁺]_i的影响具有显著差异。经与第一部分草履虫运动速率对比发现，[Ca²⁺]_i升高的时程与游动速度的增快时间相一致。结论：[Ca²⁺]_i升高可能与挥发性麻醉药物和钙调素抑制剂的兴奋性有关。第三部分草履虫胞内IP₃解笼锁导致钙离子浓度的变化对草履虫运动特性的影响目的：证实草履虫[Ca²⁺]_i变化与草履虫运动特性的关系。方法：应用激光共聚焦显微镜和IP₃解笼锁技术连续观察草履虫[Ca²⁺]_i的变化。使用汞灯为光源激发紫外光短时照射孵育有包裹的IP₃（caged IP₃）的草履虫，促使胞内笼锁住的IP₃解笼锁为游离的IP₃从而短暂升高草履虫[Ca²⁺]_i，同时记录其运动状态。结果：IP₃解笼锁可成功升高草履虫[Ca²⁺]_i至基础值35％左右，并同时促使草履虫运动增强。结论：IP₃解笼锁可升高草履虫[Ca²⁺]_i，且草履虫[Ca²⁺]_i的升高导致其运动增强。证实草履虫[Ca²⁺]_i与其运动特性具有密切相关性。第四部分挥发性麻醉药物及其类似物和正烃类物质以及钙调蛋白抑制剂对Ca²⁺/CaM亲和力的影响目的：研究不同浓度挥发性麻醉药物乙醚、恩氟烷、异氟烷和七氟烷及其类似物P485和正戊烷、正癸烷以及钙调蛋白抑制剂（W-7，CMZ）对Ca²⁺/CaM亲和力的影响，进一步探讨挥发性麻醉剂改变草履虫运动特性的作用机制。方法：用胺特异的染料Py MPO-SE标记钙调蛋白。由醛终止硅烷衍生来的盖玻片使蛋白质和表面的胺基共价结合。在重复频率为80 MHz、脉冲宽度～150 fs以及平均功率为0．5W的条件下进行操纵的氩泵浦钛：蓝宝石激光系统被用于产生基础光束。测定各药物作用于钙调蛋白后的二次谐波信号。每个数据点由每秒平均光子计数而来。结果：钙离子对照组可显著增加钙调素的二次谐波发生，而挥发性麻醉药物和钙调素抑制剂剂量依赖性的降低Ca²⁺/CaM二次谐波发生的强度。与异氟烷相同浓度的异氟烷类似物P485对Ca²⁺/CaM的二次谐波发生无影响。500 mM的正戊烷可显著降低Ca²⁺/CaM二次谐波发生的强度，而500 mM的正癸烷对Ca²⁺/CaM二次谐波发生无影响。结论：挥发性麻醉药物可浓度依赖性的抑制Ca²⁺/CaM的亲和力，其作用方式与钙调素抑制剂相吻合；同样具有麻醉作用的正戊烷亦能降低Ca²⁺/CaM的亲和力；而异氟烷类似物P485和无麻醉作用的癸烷对Ca²⁺/CaM的亲和力无影响。说明挥发性麻醉药物很可能通过抑制Ca²⁺/CaM的亲和力发挥麻醉作用。