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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.a）是肺部慢性感染的主要致病菌,也是引起机体免疫力低下和慢性反复感染的常见病原体,感染而引起的肺炎死亡率高达30%以上,而由其引起的败血症死亡率甚至达到80%-90%。对多种常见抗生素耐药,感染易反复发作,难以清除,其原因主要是极易形成生物膜（biofilm,BF）。藻多糖是P.a生物膜的主要成分,是阻止机体免疫系统反应和抗生素疗法中清除生物膜的关键因素,会导致更高的耐药性,形成生物膜的细菌可以呈现出比浮游菌高达1000倍的抗生素耐药。本课题以铜绿假单胞菌的野生型标准株PAO1为试验株,通过建立体外BF模型,探讨鼠源抗微生物肽（CRAMP）对PAO1成熟生物膜的影响;另外,本课题也考察了CRAMP对PAO1成熟生物膜藻多糖含量的影响以及PAO1成熟生物膜中藻多糖形成相关基因m RNA水平的变化。第一部分CRAMP对铜绿假单胞菌成熟生物膜抑制作用目的:观察CRAMP对PAO1成熟生物膜的影响。方法:采用96孔细胞培养板体外构建PAO1成熟生物膜模型,同时设置不同浓度的抗微生物肽CRAMP干预组、不同浓度阳性多肽（LL-37）对照组、不同浓度抗菌药（乳酸环丙沙星、恩诺沙星、硫酸庆大霉素）对照组,以及未干预的空白对照组,干预时间为1h。采用结晶紫染色法检测生物膜量,初步筛选理想的作用浓度和条件。再采用6孔细胞培养板体外构建PAO1成熟生物膜模型,采用结晶紫染色法和生物膜活菌计数联合应用定量检测生物膜,进一步验证理想浓度的干预效果。并采用激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察最佳CRAMP浓度干预下PAO1生物膜形态学变化。均以3次以上的独立试验结果进行统计分析。结果:96孔细胞培养板:CRAMP组的试验孔（CRAMP）与本试验组的空白对照孔比较在4MIC（P<0.01,生物膜量减少率为43.75%）、2MIC（P<0.01,生物膜量减少率为40.63%）、1/8MIC（P<0.05,生物膜量减少率为25%）三个浓度的条件下能有效的减少生物膜量;阳性多肽（LL-37组）与本试验组的空白对照孔比较（P>0.05）,各试验浓度均无显著性差异;硫酸庆大霉素组与本试验组的空白对照孔比较在4MIC（P<0.01,抑菌率为30.30%）、2MIC（P<0.05,抑菌率为36.36%）两个浓度下能有效减少生物膜量;恩诺沙星组与本试验组的空白对照孔比较（P>0.05）,试验浓度均无显著性差异。初步表明,试验所用药物对生物膜量的影响总体呈现剂量依赖性,4倍MIC的浓度作用效果最佳,但考虑到多肽药物浓度过高可能导致细胞毒性问题,后续试验均以该浓度进行干预。6孔细胞培养板:生物膜量检测结果显示,CRAMP（4MIC）组与本试验组的空白对照孔比较在条件下极显著降低了生物膜量（P<0.001,生物膜量减少率为76.74%）;LL-37（4MIC）组与本试验组的空白对照孔比较可显著减少生物膜量（P<0.01,生物膜量减少率为51.16%）;但两多肽组间对比,CRAMP组的生物膜量也显著小于LL-37（P<0.05）,表明CRAMP在4MIC浓度下抑制生物膜量的作用优于LL-37。另外,3个抗菌药（乳酸环丙沙星、恩诺沙星、硫酸庆大霉素）组与本试验组的空白对照孔组间差异均不显著（P>0.05）。生物膜活菌计数结果显示CRAMP组与本试验组的空白对照孔比较在4MIC条件下能极显著的减少PAO1生物膜的活菌数量（P<0.001,减少了1.16个log10CFU/m L,即90%以上的生物膜细菌被抑杀）,而LL-37组与本试验组的空白对照孔比较生物膜活菌数未见显著性变化（P>0.05）。综合分析,抗微生物肽CRAMP（4MIC）对PAO1成熟生物膜的干预作用优于LL-37和常见的3个抗菌药（乳酸环丙沙星、恩诺沙星、硫酸庆大霉素）。CLSM:通过荧光强度计算,CRAMP（4MIC）组与本试验组的空白对照孔比较比较能显著的减少细菌总荧光强度（SYTO和PI荧光强度合计,反映死菌活菌总量）（P<0.05,减少了42.41%）,LL-37（4MIC）组与本试验组的空白对照孔比较差异不显著（P>0.05）;且CRAMP（4MIC）组的细菌总荧光强度显著低于LL-37（4MIC）组（P<0.05）。表明,CRAMP对PAO1成熟生物膜的死菌和活菌总量有显著清除作用,且效果优于LL-37。CRAMP（4MIC）组与本试验组的空白对照孔比较,PI/SYTO（死菌荧光强度/活菌荧光强度）比值极显著增大（P<0.01,空白组为15.36%,CRAMP组为32.50%）,LL-37（4MIC）组与本试验组的空白对照孔比较差异显著（P<0.01,比值为30.84%）。表明,CRAMP对PAO1成熟生物膜具有明显的清除作用,对生物膜活菌也有显著的抑杀作用,且效果优于LL-37。结论:一定浓度的CRAMP能在短时间内抑制PAO1成熟生物膜,且在4MIC时能有效的清除成熟生物膜,并杀灭大量生物膜细菌,效果优于采用的3种常见抗菌药和典型抗微生物肽LL-37。第二部分CRAMP对铜绿假单胞菌成熟生物膜中胞外多糖的抑制作用目的:观察CRAMP对PAO1成熟生物膜中胞外多糖（EPS）的影响。方法:6孔板体外构建PAO1成熟生物膜模型,同时设置4MIC浓度的抗微生物肽CRAMP干预组、4MIC浓度阳性多肽（LL-37）对照组以及未干预的空白对照组。采用苯酚—硫酸法检测PAO1成熟生物膜中多糖含量以及Folin-酚试剂法检测PAO1成熟生物膜中蛋白质含量;两者检测值之和即为胞外多糖含量。结果:CRAMP组与本试验组的空白对照孔比较胞外多糖含量显著降低（P<0.05,含量降低了36.64%）,LL-37组与本试验组的空白对照孔比较差异不显著（P>0.05）,且CRAMP组的胞外多糖较LL-37显著减少（P<0.05,减少率为34.38%）。结论:CRAMP（4MIC）能有效减少PAO1成熟生物膜中胞外多糖的含量,且效果优于LL-37。第三部分CRAMP对PAO1成熟生物膜中藻多糖的影响目的:观察CRAMP对PAO1成熟生物膜中藻多糖（成熟生物膜胞外多糖的主要成分）含量的影响以及检测PAO1成熟生物膜中藻多糖合成相关基因m RNA水平的变化。方法:（1）6孔板体外构建PAO1成熟生物膜模型,同时设置4MIC浓度的抗微生物肽CRAMP干预组、4MIC浓度阳性多肽（LL-37）对照组,以及未干预的空白对照组（2）紫外分光光度法检测生物膜藻多糖含量;（3）RT-PCR检测PAO1成熟生物膜中藻多糖合成相关基因（Alg D、Alg U、Muc A）m RNA水平的变化。结果:（1）CRAMP对PAO1成熟生物膜中藻多糖含量的影响:CRAMP组与本试验组的空白对照孔比较,藻多糖含量显著下降（P<0.05,降低了78.41%）,LL-37与本试验组的空白对照孔比较,差异不显著（P>0.05）。另外CRAMP组较LL-37组也显著降低（P<0.05,降低了54.09%）。表明,CRAMP能显著减少PAO1成熟生物膜藻多糖的产生,效果优于LL-37;（2）PAO1成熟生物膜中藻多糖形成相关基因m RNA水平的变化:通过各基因的相对表达量分析可知,CRAMP对成熟生物膜中藻多糖相关基因m RNA水平的影响,无显著差异,alg D、alg U、Muc A基因的上调/下调均无显著差异。结论:CRAMP（4MIC）对PAO1成熟生物膜的重要胞外多糖——藻多糖具有明显的干预作用,但藻多糖的合成相关基因的m RNA水平无显著变化。初步表明,CRAMP对PAO1成熟生物膜中的藻多糖的干预作用不是通过其合成途径发挥的,推测可能是影响了藻多糖转运或裂解调控。