研究背景与目的肝内胆管细胞癌([ntrahepatic cholangiocarcinoma, ICC),又被称为外周型胆管癌,或者胆管癌之肝内型,它是肝内胆管被覆上皮发生的,并起源于肝内二级分支以下胆管上皮的原发性肝癌的其中一种类型,据世界范围内统计,ICC约占原发性肝脏所发生恶性肿瘤的10%-15%,其发生率仅次于肝细胞癌(HCC),但近年来已经上升为肝内原发肿瘤导致死亡的第一位,目前认为,肝内胆管癌的发生与胆管结石、乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎感染以及其他胆管发生的炎症等因素密切相关。肝内胆管癌具有发生隐匿、临床症状不典型、恶性程度高、发展迅速、容易转移等特点,尽管目前在早期诊断和治疗方法上有了很大改进,但是仍不能改变其不良预后,因此发现新的、有效的抗肝内胆管癌的方法是当务之急。随着广大研究者对肿瘤分子机制不断的深入认识,现在已将恶性肿瘤定义为一种多因子、多步骤和多基因参与的全身性疾病,因此,在近10年中,肿瘤的生物学治疗以及基因治疗成为肿瘤治疗的研究热点和新希望。间充质干细胞(MSCs)是干细胞的一种类型,因其能分化成间质组织而得名,MSCs是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞,在特定的诱导环境下,可进一步分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉等组织,目前,MSCs已被广泛应用于细胞治疗及组织再生方面的研究。人脐带来源的间充质干细胞因较其他来源的干细胞具有更明显的优势,所以越来越受到人们的重视,研究表明,人脐带组织中分离得到的间充质干细胞既具有较强的增殖能力,又具有向其它类型细胞(神经元样细胞、少突胶质细胞、脂肪细胞及星形胶质细胞等)分化的能力,加之其来源广泛、易获得且具有较强的肿瘤趋化能力等特点,在细胞移植及基因治疗、组织工程等方面具有广阔的应用前景。因干细胞强的肿瘤趋化能力,很多研究者聚焦于其与肿瘤细胞之间的关系,干细胞移植技术已应用于几种造血及非造血肿瘤的治疗,将干细胞应用于肿瘤治疗具有广泛的前景,有研究证实,某些实体肿瘤的生长可被干细胞所抑制,另有研究显示,这种抑制作用是通过干细胞自身分泌的可溶性活性因子实现的。但是,目前尚没有关于间充质干细胞对肝内胆管癌细胞作用研究的相关报道,因此本研究对此作用及其分子机制进行了初步探讨。本研究通过Transwell共培养实验、MTT比色实验、DNA断裂实验等方法,检测脐带间充质干细胞对肝内胆管癌HCCC-9810细胞增殖和凋亡的影响,同时借助于Western Blot及免疫荧光染色方法,检测与肝内胆管癌发生发展密切相关通路中蛋白质表达水平的变化,进一步探讨脐带间充质干细胞作用于肝内胆管癌细胞生长可能的分子机制。第一部分人类脐带间充质干细胞对肝内胆管癌细胞生长的影响研究目的1、检测人类脐带间充质干细胞对肝内胆管癌HCCC-9810细胞生长的影响。2、检测不同浓度人类脐带间充质干细胞条件培养基对肝内胆管癌HCCC-9810细胞生长的影响。3、检测人类脐带间充干细胞条件培养基对肝内胆管癌HCCC-9810细胞生长的影响是否由诱导HCCC-9810细胞凋亡所介导。4、检测人类脐带间充质干细胞及其条件培养基对裸鼠肝内胆管癌移植瘤生长的影响。研究方法1、采用transwell共培养系统共培养人类脐带间充质干细胞(HUVECs细胞作为对照)与HCCC-9810细胞,应用细胞计数法计数处理后的肿瘤细胞数。2、配置不同浓度的干细胞条件培养基(10%、25%、50%、75%)处理HCCC-9810细胞,应用MTT细胞增殖实验及细胞克隆实验测定HCCC-9810细胞增殖率的变化。3、应用Hoechst33258染色实验检测干细胞条件培养基诱导HCCC-9810细胞凋亡的作用。4、采用皮下注射细胞悬液的方法,构建裸鼠移植瘤模型,测量注射不同细胞组间肿瘤发生率及体积大小,并采用脐带间充质干细胞条件培养基注射于已形成肿瘤部位的方法,测量肿瘤体积的变化。5、采用SPSS16.0统计软件用于实验数据的统计学分析,数据的统计学意义通过独立组间学生t检验,采用(x±S)进行分析。结果1、脐带间充质干细胞对肝内胆管癌HCCC-9810细胞增殖的影响HCCC-9810细胞与hUC-MSCs细胞共培养48h后,计数细胞为7.64×105个／m1,而与HUVECs细胞共培养48h后,细胞计数为11.98×105个/ml,由此可见,脐带间充质干细胞诱导的HCCC-9810肿瘤细胞抑制效应明显高于HUVECs对照组,与对照组相比,肿瘤细胞增殖率下降了34.4%,差异具明显的统计学意义(p<0.05)。为了进一步检测培养的脐带间充质干细胞微环境是否能抑制肿瘤细胞的生长,我们检测了干细胞条件培养基对HCCC-9810细胞增殖的影响,结果显示,HCCC-9810细胞经不同浓度间充质干细胞条件培养液处理后,细胞增殖抑制率呈现时间与剂量依赖性,HCCC-9810细胞经50%间充质干细胞条件培养基培养24小时后,增殖抑制率由6.21%增至49.86%,与对照组相比有显著差距。我们又采用了细胞克隆实验进一步证实这种抑制作用的存在,结果显示,与对照组相比,脐带间充质干细胞条件培养基处理组细胞克隆单位形成数明显低于对照组(p<0.01)。2、脐带间充质干细胞条件培养液对HCCC-9810细胞凋亡的影响为了证实干细胞条件培养基对HCCC-9810细胞的增殖抑制是否由凋亡介导,进一步采用DNA染色的方法观察核染色质形态。结果显示,HCCC-9810细胞经50%脐带间充质干细胞条件培养液处理48h后,经Hoechst33258染色呈现明显细胞凋亡,凋亡细胞比率明显高于对照组,与对照组相比,差异具明显的统计学意义(p<0.05VS.HUVEC对照组)。3、脐带间充质干细胞抑制BALB/C裸鼠移植瘤的形成结果显示,皮下注射不同细胞组50天后,注射HCCC.9810+MSC细胞组,移植瘤出现时间及肿瘤体积均明显低于对照组：观察至第35-40天,有7只裸鼠长出可视肿瘤(观察至第50天,平均肿瘤体积约为1.3cm3),此组中另外3只裸鼠始终无肿瘤发生。注射HCCC.9810细胞组,或者HCCC.9810+HUVEC细胞组中所有实验小鼠均形成了可视肿瘤(观察至第50天,平均肿瘤体积分别为2.6cn13,2.5cm3).实验的50-70天,分别给HCCC-9810实验组继续注射间充质干细胞或者HUVECs细胞的条件培养基,结果显示,注射间充质干细胞条件培养基组,原本已形成的肿瘤体积明显缩小,至实验结束,干细胞条件培养基处理组小鼠肿瘤的平均体积降至1.4cm3,而对照组肿瘤体积继续增长至3.5cm3,差异具显著的统计学意义。结论1、脐带间充质干细胞可抑制肝内胆管癌HCCC-9810细胞的生长。2、经50%脐带间充质干细胞条件培养基处理肝内胆管癌HCCC-9810细胞24小时可达到细胞的半数抑制率。3、脐带间充质干细胞可抑制BALB/C裸鼠移植瘤的形成,且其条件培养基可使已形成的肿瘤体积缩小。4、脐带间充质干细胞对肝内胆管癌HCCC-9810细胞生长的抑制作用是通过诱导细胞凋亡所介导的。第二部分人类脐带间充质干细胞阻抑肝内胆管癌细胞生长的分子机制研究目的1、检测经脐带间充质干细胞条件培养基作用后,肝内胆管癌HCCC-9810细胞中PI3K/Akt信号转导通路主要蛋白的表达水平变化。2、检测经脐带间充质干细胞条件培养基作用后,肝内胆管癌HCCC-9810细胞中Wnt/β-catenin信号转导通路主要蛋白的表达水平变化。3、检测加入GSK-3β(?)抑制剂或者激活剂,或加入Akt激活剂,作为单一处理因素,或者联合脐带间充质干细胞条件培养基处理HCCC-9810细胞,所介导的肝内胆管癌细胞增殖及相关蛋白的变化。研究方法1、Western Blot方法检测肝内胆管癌HCCC-9810细胞经脐带间充质干细胞条件培养基处理前后p-PI3K、p-PDK1、p-Akt Aktp-GSK-3β、GSK-3β、β-Catenin、 c-Myc、CyclinD1等蛋白的表达变化。2、细胞免疫荧光染色方法检测肝内胆管癌HCCC-9810细胞经脐带间充质干细胞条件培养基处理前后p-Akt、p-GSK-3β、β-Catenin的表达变化。3、分别加入GSK-3β特异性激活试剂SNP及特异性抑制试剂CHIR99021作为单一处理因素,或者与脐带间充质干细胞条件培养基联合作用后,观察肝内胆管癌HCCC-9810细胞增殖能力变化,并进一步检测β-Catenin的表达变化。4、加入Akt特异性激活剂IGF-1预处理HCCC-9810细胞15min后,进一步观察脐带间充质干细胞条件培养基对肝内胆管癌HCCC-9810细胞增殖能力的影响。结果1、hUC-MSCs条件培养基可抑制肝内胆管癌HCCC-9810细胞中PI3K/Akt信号转导通路相关蛋白的表达1) Western Blot实验结果显示,HCCC-9810细胞经50%hUC-MSCs条件培养基处理48小时后,与对照组相比,p-PI3K、p-PDK1、p-Akt、p-GSK-3β的表达明显下调,而总的Akt(T-Akt)与总的GSK-3β(T-GSK-3β)的表达无明显变化,而HUVEC条件培养基处理组上述蛋白表达与空白对照组相比无明显变化。统计显示,HUVEC条件培养基处理组与hUC-MSC条件培养基处理组相比,p-Akt与T-Akt的灰度比值分别为0.65±0.04及0.19±0.02(P<0.001),p-GSK-3β与T-GSK-3β的灰度比值分别为0.48±0.03及0.22±0.05(P<0.01),比值差异均具有明显的统计学意义。2)细胞免疫荧光染色结果显示,与空白对照组相比,干细胞条件培养基处理组p-Akt、p-GSK-3β的相对荧光强度分别为37.3±0.8%、35.7±1.2%,空白对照组p-Ak、p-GSK-3β的蛋白荧光强度明显高于干细胞条件培养基处理组,两组间差异的统计学意义较显著(P<0.01, p-Akt; P<0.01, p-GSK-3β).2、hUC-MSCs条件培养基可抑制肝内胆管癌HCCC-9810细胞中Wnnt信号转导通路相关蛋白的表达1) Western Blot实验结果显示,肝内胆管癌HCCC-9810细胞经50%hUC-MSCs条件培养基处理48小时后,与空白对照组相比,β-catenin、c-Myc、cyclin-D1的表达明显下调,并且β-catenin的核富集量明显减少,而HUVEC条件培养基处理组β-catenin、c-Myc、cyclin-D1的蛋白表达情况几乎与空白对照组相似。2)细胞荧光免疫染色结果显示,干细胞条件培养基处理组β-catenin在细胞核中荧光强度较空白对照组明显减弱。3、hUC-MSCs条件培养基通过Akt通路调节GSK-3β的活性,从而下调β-catenin的表达,抑制Wnnt通路经GSK-3β抑制剂(CHIR99021)处理后,48h观察点结果显示,CHIR99021与hUC-MSCs条件培养基联合处理组与hUC-MSCs条件培养基单独处理组相比,HCCC-9810细胞的抑制作用明显减弱p<0.001),并且CHIR99021与hUC-MSCs条件培养基联合处理组增加了β-catenin的蛋白表达水平。而经GSK-3β激活剂(SNP)处理后,48h观察点结果显示,SNP与hUC-MSCs条件培养基联合处理组与hUC-MSCs条件培养基单独处理组相比,HCCC-9810细胞的抑制作用明显增强(p<0.001),并且SNP与]hUC-MSCs条件培养基联合处理组下调了β-catenin的蛋白表达水平。加入Akt通路激活剂IGF-1预处理HCCC-9810细胞15min后,24h观察点结果显示,IGF-1与hUC-MSCs条件培养基联合处理组与hUC-MSCs条件培养基单独处理组相比,IGF-1与hUC-MSCs条件培养基联合处理组对HCCC-9810细胞的抑制作用明显下降(p<0.05)。结论1、hUC-MSCs条件培养基可通过抑制PI3K/Akt信号通路阻抑肝内胆管癌HCCC-9810细胞生长。2、hUC-MSCs条件培养基亦可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路阻抑肝内胆管癌HCCC-9810细胞生长。3、hUC-MSCs条件培养基对肝内胆管癌细胞的抑制作用可能是通过以GSK-3β作为“桥梁蛋白”的Akt和Wnnt两条通路的串话实现的。