论文部分内容阅读
磷素在植物整个生命活动中发挥重要作用,但土壤中有效磷浓度较低,加上该元素在土壤中极易被固定,致使植物出现缺磷现象,严重影响了植物的生长发育,因此发掘及利用低磷诱导的相关基因对提高植物对低磷环境的耐受能力具有重要作用。在植物响应低磷胁迫中MYB类转录因子（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）发挥着重要的作用。我国亚热带地区马尾松是主要的造林树种,但目前南方地区许多土壤缺磷现象严重,使马尾松的生长受到影响。在前期工作中,课题组对马尾松耐低磷种质进行了转录组分析,从中发掘了MYB类转录因子应答低磷胁迫差异表达,并克隆出马尾松磷转运相关基因PmMYB169的全长序列,探讨了PmMYB169基因在耐低磷方面可能存在的重要作用。为更进一步了解该基因在磷吸收及利用上的功能,本文构建了PmMYB169基因的正义表达载体,并遗传转化拟南芥及烟草,对PmMYB169基因进行亚细胞定位,以确定其发挥作用位置;对转基因植株进行不同磷浓度处理,探讨转基因植株在磷胁迫下的生长及生理生化特性,旨在为解析该基因的耐低磷机制提供新信息,为耐低磷种质的早期筛选提供理论参考,主要结果如下:1.将构建的植物表达载体pCAMBIA1301-PmMYB169通过浸花法及农杆菌介导的叶盘法分别遗传转化拟南芥及烟草烟草,PCR鉴定获得2株T3代转基因拟南芥纯合株系,以及22株转基因烟草株系;经荧光定量qRT-PCR检测,从转基因烟草中筛选出3个表达量较高的转基因株系（Line-2、Line-11、Line-16）进行后续实验。2.对转基因与野生型拟南芥进行不同浓度磷胁迫处理,检测其生理生化反应。结果表明,低磷胁迫下,转基因植株中酸性磷酸酶活性、根部无机磷和总磷含量以及生物量都高于野生型;唯有花青素含量低于野生型;在正常磷条件下,转基因与野生型拟南芥的酸性磷酸酶活性（acid phosphatase,APase）、生物量、无机磷、总磷及花青素含量均无明显差异。说明高表达PmMYB169基因能显著提高植株在低磷环境中磷的吸收及利用,进而增强植株耐低磷胁迫能力。3.转基因与野生型烟草以不同浓度磷胁迫,检测其生理生化反应。结果表明低磷胁迫下,除了MDA含量低于野生型之外,磷含量、生物量、Apase活性、POD活性及SOD活性在转基因烟草中均显著高于野生型;而正常磷及高磷条件下,转基因与野生型植株并无明显差异。因此,超表达PmMYB169基因显著提高了植株的耐低磷能力。4.不同磷处理下转基因拟南芥及烟草中外源基因表达分析显示,缺磷条件下转基因拟南芥植株中PmMYB169基因表达量显著提高,且在根部表达较为明显;低磷处理后转基因烟草植株在无磷与低磷胁迫下PmMYB169基因表达量显著提高,高磷处理下则相反,结合其生理生化测定结果,说明转PmMYB169基因进一步提高植株对介质中体内磷的再利用效率。5.超表达PmMYB169基因对拟南芥高亲和磷转运蛋白Pht1家族基因PHT1;1及PHT1;4的表达分析显示,在低磷条件下转基因植株根部PHT1;1表达量较野生型显著上调,虽然PHT1;4在根部表达也比地上部分高,但该基因表达量在野生型与转基因植株中无显著差别,这意味着PmMYB169对拟南芥PHT1;1作用明显,可能通过正调控而促进PHT1;1的表达,从而促进植株对磷的利用率,提高植株耐低磷胁迫的能力。6.超量表达PmMYB169的转基因烟草对高亲和磷转运蛋白Pht1家族基因NtPT1及NtPT4的表达分析显示,超表达PmMYB169增强了烟草自身高亲和磷转运蛋白基因NtPT1及NtPT1的表达,虽然NtPT4基因的表达上调,但转基因植株与野生型中该基因的表达无明显差异,说明植物磷转运蛋白之间可能存在协同作用。7.将pBWA（V）HS-PmMYB169-GLosgfp表达载体与作为对照的载体pBWA（V）HS-GFP转化到烟草叶片中进行瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜观察表明,PmMYB169在烟草叶片细胞核中表达。烟草的亚细胞定位更加有效确定马尾松PmMYB169基因在细胞核中发挥作用,这为进一步理解PmMYB169基因的功能提供了新信息。