冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)严重危害人类健康,被称为"人类健康第一杀手",在我国也不例外,近年来已成为我国居民的主要致死病因之一。冠心病发生、发展的机制十分复杂,近年的研究表明内皮功能障碍在冠心病的发生、发展中扮演关键角色。内皮功能障碍的本质是内皮损伤和修复之间动态平衡的破坏,而内皮祖细胞(EPCs)在内皮损伤后的修复中起重要作用。EPCs参与缺血组织的血管新生、促进损伤血管内皮的修复、维持内皮功能完整。近年的研究表明氧化应激对于EPCs的功能具有重要作用。氧化应激是指活性氧族(ROS)产生过多或发生代谢障碍并超过内源性抗氧化防御系统对其的消除能力时,反应性氧化物包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H202)和羟基产物(-OH),通过与DNA、蛋白质和脂质相互作用,产生过多的损伤的DNA碱基、蛋白质氧化产物和脂质过氧化产物,并导致溶酶体、线粒体的损伤。研究表明氧化应激使EPCs动员减少,削弱EPCs的粘附、增殖、迁移能力,促进EPCs的衰老,诱导其凋亡。研究还表明在内皮细胞和干/祖细胞,ROS主要来自NADPH氧化酶。NADPH氧化酶是ROS主要调控酶,可以作为氧化应激状态的一个指标,但是氧化应激在稳定性冠心病患者EPCs数量和功能变化中的作用目前尚不清楚。此外,NADPH氧化酶的激活需要胞质亚单位和细胞膜上的p22phox、gp91phox(Nox2)亚单位的结合。胞质亚单位的磷酸化及随后转位至细胞膜是NADPH氧化酶活化的关键步骤。许多研究已经证实了 PKC在其中扮演了重要的角色。NADPH氧化酶的激活可以促进P38MAPK和ERK1/2磷酸化,P38MAPK磷酸化可以导致EPCs数量下降、功能受损和细胞老化,ERK1/2的激活跟EPCs的迁移有关,而ERK2的激活跟EPCs粘附功能有关。NADPH氧化酶的激活还可以促进Akt的磷酸化,而PI3K/Akt/eNOS信号转导途径在EPCs功能和衰老的调控中扮演重要的角色,我们在先前的研究中也证实SDF-1、胸腺素β4、同型半胱氨酸、尼古丁及葛根素等均通过PI3K/Akt/eNOS信号转导途径影响EPCs功能和衰老。基于上述理论基础,我们提出假设:(1)冠心病患者EPCs功能受损与氧化应激密切相关;(2)PKC在冠心病患者EPCs内NADPH氧化酶激活中起重要作用;(3)NADPH氧化酶介导的氧化应激通过PI3K/Akt/eNOS、ERK和P38MAPK信号途径影响EPCs功能和细胞衰老。以下是研究假设图:1稳定性冠心病内皮祖细胞氧化应激水平增高,功能受损目的观察稳定型冠心病内皮祖细胞的氧化应激水平,评价EPCs的抗氧化能力、旁分泌和在体血管生成能力。方法入选性别、年龄基本匹配的20例非糖尿病的稳定性冠心病患者和20例非冠心病和糖尿病患者,收集、培养冠心病和对照组的外周血,采用密度梯度离心法获取单个核细胞,接种于人纤维连接蛋白包被的培养板,培养2-3周后,获得晚期EPCs。双染和流式鉴定后用荧光探针法检测ROS浓度,硫代巴比妥酸(TBA)法检测脂质氧化产物MDA浓度,光泽精法检测NADPH酶活性;然后用细胞裂解液裂解细胞后收集蛋白,分别用各试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,过氧化氢酶(CAT)活力和胞内一氧化氮(NO)浓度。采用定量RT-PCR和western blot检测EPCs内Gpx、Cu/Zn SOD和MnSOD的mRNA和蛋白表达情况。ELISA法检测细胞内中VEGF、IL-8、SDF-1、HGF的水平。另外,通过建立大鼠下肢缺血模型EPCs移植评估冠心病EPCs的在体血管生成能力。结果稳定型冠心病患者与正常对照相比,EPCs内ROS水平和MDA水平明显升高,NADPH氧化酶活性增加,EPCs分泌VEGF、IL-8、SDF-1降低,抗氧化酶系统中SOD和CAT活性增加,胞内NO浓度增加,转录和翻译水平提示冠心病患者EPCs内Gpx和MnSOD的mRNA表达和蛋白表达均增强,Cu/znSOD则无显著差异。大鼠下肢缺血模型试验提示冠心病患者EPCs较正常对照组在体成血管能力减弱。结论稳定型冠心病患者EPCs内NADPH氧化酶激活,氧化应激水平增高,抗氧化酶活性降低,旁分泌功能和在体成血管能力减弱。2稳定型冠心病患者内皮祖细胞内NADPH氧化酶的激活机制目的观察和探讨稳定型冠心病患者EPCs内NADPH氧化酶激活的过程及机制。方法培养、收集冠心病和对照组的EPCs,分别采用qPCR和westemblot检测EPCs内NADPH氧化酶p22phox、p47phox、gp91phox和Nox4亚单位mRNA和蛋白的表达,然后采用免疫沉淀法检测EPCs内p47phox与Nox2或其同源物Nox4结合情况,细胞免疫荧光法进一步检测EPCs内p47phox膜转位情况。最后采用western blot检测冠心病和正常对照组EPCs内PKCα,PKCβ1/2同工酶的表达差异,以及用PKC抑制剂G06983抑制PKC活性后,EPCs内NADPH氧化酶活性和ROS水平的变化,NADPH氧化酶各亚基的表达水平的变化。结果稳定型冠心病患者EPCs内,NADPH氧化酶亚基p47phox、p22phox、gp91phox以及Nox4的表达上调。免疫沉淀和细胞免疫荧光检测提示p47phox亚单位发生膜转位,并与胞膜亚单位Nox4结合的比例增加。此外,冠心病EPCs内PKCα,PKCβ2的磷酸化增强,PKCβ1则无明显变化。当PKC活性被抑制后,NADPH氧化酶活性和 ROS 产生减少,gp91phox、p22phox、p47phox、Nox4 表达减少。结论稳定型冠心病患者EPCs内NADPH氧化酶各亚基表达上调,并通过p47phox转位至胞膜与Nox4亚单位结合而激活,其中PKCα/β2信号途径可能参与激活。3 NADPH氧化酶影响冠心病患者EPCs功能和细胞衰老的可能机制目的探讨NADPH氧化酶影响冠心病患者EPCs迁移、粘附和细胞衰老的可能机制。方法培养、收集冠心病和对照组的EPCs,采用western blot检测EPCs内Akt、eNOS、ERK和P38MAPK的表达及其磷酸化水平,改良的Boyden小室法和细胞粘附试验检测细胞迁移和粘附功能,SA-ββ-半乳糖苷酶染色法检测EPCs衰老。然后采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和夹竹桃麻素(apocynin)抑制NADPH氧化酶以及siRNA干扰技术抑制NADPH氧化酶p47phox,Nox2,Nox4亚单位,检测抑制后EPCs内NADPH氧化酶活性,ROS水平和NO活性,Akt、eNOS、ERK和P38MAPK的表达及其磷酸化水平,以及EPCs的迁移,粘附和衰老的变化。最后,采用通路抑制剂SB203580,PD98059,LY294002,L-NAME等,观察各信号通路在冠心病患者EPCs内迁移、粘附和细胞衰老中的作用。结果NAC和apocynin及各亚基siRNA分别抑制冠心病患者EPCs的NADPH氧化酶活性、ROS活性和NO浓度。稳定型冠心病患者EPCs内Akt、eNOS、ERK和P38MAPK的磷酸化减弱,迁移和粘附能力减弱,衰老加快。抑制NADPH氧化酶后上述作用逆转,且不同亚基分别对不同的通路和功能起作用。结论稳定型冠心病患者EPCs中,NADPH氧化酶的激活对P38MAPK、ERK和PI3K/Akt/eNOS信号通路的激活有重要的调节作用,NADPH氧化酶在冠心病EPCs内可能通过P38MAPK、ERK和PI3K/Akt/eNOS信号通路影响EPCs的迁移、粘附和衰老。