论文部分内容阅读
脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合症(systemic inflammation response syndrome, SIRS),进一步可发展为严重脓毒症、脓毒症休克。近年来其发病率和死亡率仍居高不下,脓毒症死亡率接近20%,而脓毒症休克死亡率更是高达60%。脓毒症由于初始阶段过度的全身炎症反应综合症(SIRS)和相伴随的代偿抗炎反应综合症(Compensatory anti-inflammatory response syndrome,CARS),严重扰乱机体正常的免疫平衡状态。反之,严重的免疫功能紊乱又将影响感染的控制和机体对已发生的病理生理反应的调控。免疫功能障碍与脓毒症发展及预后不良密切相关,适时制定相应的免疫调控策略,可能为改善脓毒症治疗开辟新的途径。鱼油脂肪乳富含n-3多不饱和脂肪酸(n-3 Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs)如二十碳五烯酸(Eicosapntemacnioc acid, EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA),而大豆油脂肪乳主要含n-6 PUFAs如花生四烯酸(Arachidonic acid, AA)。研究发现富含鱼油的肠外营养治疗具有抑炎、免疫调理作用,但是否改善脓毒症的预后目前尚存争议。此外,对于n-3PUFAs如何发挥免疫调理作用的机制仍未完全明确。在本课题中,我们首先行盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)制作大鼠脓毒症模型,给予含鱼油或大豆油的肠外营养治疗5天,观察对生存率的影响和重要脏器病理改变以及局部和全身细菌负荷变化；在此基础上,探究n-3PUFAs对脓毒症免疫功能和炎症反应的影响,并进一步探讨n-3PUFAs改善脓毒症免疫功能和炎症调理作用的可能机制；为富含n-3PUFAs的肠外营养治疗脓毒症奠定理论基础,并进一步指导临床应用。全文共分三部分：第一部分n-3 PUFAs对脓毒症大鼠生存率和重要脏器细菌负荷的影响目的：建立脓毒症肠外营养治疗模型,观察n-3 PUFAs对生存率、重要脏器病理改变和细菌负荷的影响。方法：SD大鼠随机分为四组：假手术对照组(Sham group, n=10),行假手术处理后自由饮食；生理盐水组(NS group, n=20), CLP制作脓毒症模型后接受静脉输注生理盐水5天；大豆油组(SO group, n=20), CLP制作脓毒症模型后接受含大豆油的肠外营养治疗5天；鱼油组(FO group, n=20), CLP制作脓毒症模型后接受含鱼油的肠外营养治疗5天。每日定时记录CLP术后5天内各组体重和生存情况；取肺脏、脾脏行病理检查,比较病理评分；取腹腔灌洗液、肺、肾、和脾脏行细菌培养,计数菌落数。结果：成功建立脓毒症大鼠肠外营养治疗的模型；脓毒症大鼠体重较对照组明显下降,NS组下降最明显,但鱼油组与大豆油组无明显差异；脓毒症大鼠存活率明显下降,FO组较NS组生存率改善(65% vs 25%, p<0.05), SO组与NS组无明显差别(45% vs 25%,p>0.05)。鱼油减轻了脓毒症对肺脏、脾脏病理损害,降低了相应的病理评分；同时腹腔灌洗液、肺、肾、脾细菌菌落数较NS组和SO组明显减少。结论：富含n-3 PUFAs的肠外营养治疗提高了脓毒症大鼠的存活率,减轻了重要脏器的病理损害和降低了细菌负荷,可能与细菌清除能力增强有关。第二部分n-3 PUFAs对脓毒症免疫功能的保护和炎症调理作用的研究目的：探讨n-3PUFAs对脓毒症免疫功能的影响及其炎症调理作用。方法：实验分组和处理因素同第一部分；流式细胞术检测外周血和脾脏CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞比例、(CD4+/CD8+T细胞比值变化,以及CD4+CD25high Treg占CD4+T细胞比例和绝对数变化；RT-PCR检测脾脏单个核细胞Foxp3 mRNA表达,蛋白免疫印迹(western-blot)方法检测Foxp3蛋白表达；ELISA法检测血浆IL-10, HMGB1浓度。结果：脓毒症导致外周血、脾脏主要T淋巴细胞亚群比例紊乱,CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞比例下降,CD4+/CD8+T细胞比值降低；FO组血CD3+CD4+T细胞比例、CD4+/CD8+T细胞比值较NS组和SO组均显著增高(p<0.05)；FO组脾脏CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞比例,CD4+/CD8+T细胞比值较NS组和SO组均显著增高；脓毒症大鼠血和脾脏CD4+CD25high Treg/CD4+T细胞比例和绝对数较对照组均增高,但FO组血和脾脏CD4+CD25high Treg/CD4+T细胞比例和绝对数均低于NS组和SO组(p<0.01, p<0.05)。FO组Foxp3在mRNA和蛋白表达水平较NS组和SO组均降低。此外,脓毒症导致血浆IL10和HMGB1浓度均有不同程度升高,而在FO组其浓度较NS和SO组降低。结论：脓毒症导致血和脾脏T淋巴细胞亚群比例失调,导致免疫功能紊乱；脓毒症早期给予富含n-3PUFAs的肠外营养治疗可发挥免疫保护作用,并可调理炎症介质的平衡。第三部分n-3 PUFAs对血浆和红细胞膜磷脂脂肪酸组成以及TLR4-NFκB信号转导通路的影响目的：观察富含n-3PUFAs的肠外营养对脓毒症大鼠血浆、红细胞膜磷脂脂肪酸组成影响,并探讨对脾单个核细胞TLR-4-NF-κB信号转导通路的影响。方法：实验分组及处理因素同第一部分。气相色谱法检测血浆、红细胞膜磷脂脂肪酸AA、EPA、DHA 及(EPA+DHA)/AA的变化；提取脾脏单个核细胞RNA, RT-PCR法测定TLR4、MYD88、NF-κBmRNA表达；并进一步提取细胞总蛋白和核蛋白,用蛋白免疫印迹(western-blot)方法检测不同处理因素对TLR4、 MYD88、NF-κB在蛋白表达水平的影响。结果：脓毒症大鼠血浆AA浓度较假手术对照组明显升高,FO组血浆EPA、DHA浓度和(EPA+DHA)/AA较其余三组明显升高,而NS、SO组血浆(EPA+DHA)/AA较假手术对照组明显降低；NS、FO组红细胞膜AA水平明显低于假手术对照、SO组,SO组与假手术对照组无统计学差异,FO组EPA、DHA和(EPA+DHA)/AA明显高于其他三组。CLP术后5天,脓毒症大鼠TLR4、MYD88、NF-κB (p65)无论在mlRNA还是蛋白水平表达较对照组明显升高,而n-3PUFAs明显抑制了其高表达。结论：脓毒症后早期给予富含n-3PUFAs的肠外营养治疗能够改善脓毒症预后,可能通过改变血浆和红细胞膜磷脂脂肪酸组成影响细胞功能,并进一步通过调节单个核细胞TLR4-NF-κB信号转导通路而实现。