论文部分内容阅读
证型是中医基础理论和临床应用的关键。由于肾在脏象学中居于重要地位,有关肾阳虚证的研究受到极大关注。为使肾虚证的研究更加客观可控并具重复性,近几十年来学术界一直关注肾阳虚证模型的研究。已有的研究发现肾阳虚患者下丘脑-垂体及其三个靶腺(肾上腺、甲状腺、性腺)(Hypothalamic-pituitary-adrenocortical system,HPA)功能紊乱,温阳补肾药能特异性的提高下丘脑促皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone, CRH)水平,并能改善糖皮质激素对免疫抑制作用。HPA轴及其三个靶腺功能低下被认为是肾阳虚证的物质基础,但HPA轴及其所属三个靶腺涉及范围非常广泛,为便于临床诊断和科学研究,必须找到简单易测的客观指标。研究表明糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)是HPA轴中重要的激素受体,皮质醇必须与GR结合才能发挥生物效应,GR表达下调是否是肾阳虚证产生的原因之一呢?基于以上研究结果我们提出以下假设: GR是肾阳虚证的观察指标,抑制GR基因作为肾阳虚证的建模方法。目前抑制基因表达主要有以下几种方法:基因敲除、RNA干扰、反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides,AS-ODN)等。敲除动物GR基因会使GR在机体所有的组织、器官中几乎完全丧失,动物多于出生后随即死亡,或者胎死腹中,不能模拟肾阳虚证发生时的自然情况。RNA干扰技术能部分抑制特定基因表达,但是目前RNA干扰技术主要用在细胞水平抑制特定基因表达,或者在短时间内抑制动物特定基因表达,不能达到长时间动物水平基因表达抑制的目的。AS-ODN也是抑制特定基因表达的手段之一,能达到较好的特定基因表达抑制的效果,但其半衰期短,不能用于长时期基因表达抑制。随着缓释技术的发展,AS-ODN技术和缓释技术结合后能延长AS-ODN抑制基因表达的时间。可降解聚乳酸微球就是缓释技术中的一种。是否能将AS-ODN技术与可降解聚乳酸微球技术结合起来在动物水平达到较好的抑制GR基因表达的目的?目的:1.制备载AS-ODN可降解聚乳酸微球,为建立GR表达抑制动物模型提供基础。2.通过对三周龄C57小鼠皮下注射不同剂量载AS-ODN可降解聚乳酸微球,找出抑制GR基因表达效果最好的微球量。3.观察GR表达抑制和肾阳虚证的相关性。方法:1.根据GR基因序列并参考文献设计出AS-ODN序列及对应的正义寡核苷酸序列,采用复乳化法冷冻干燥法制备载AS-ODN可降解聚乳酸微球。观察微球形态、载药率等监测微球质量。2.应用不同剂量的载AS-ODN可降解微球皮下注射C57小鼠以建立GR基因敲低的肾阳虚小鼠模型,对该模型采用RT-PCR的方法进行鉴定,筛选出有效的用药剂量,并用该剂量的可降解微球注射作为建立肾阳虚小鼠模型的方法。3.用温补肾阳中药干预GR表达抑制的C57小鼠,然后采用RT-PCR及Western blot的方法分别验证GR在mRNA及蛋白水平的表达情况,以此来观察温阳补肾中药是否能提高被抑制的GR表达水平。结果:通过复乳-溶剂挥发法制备载AS-ODN可降解聚乳酸微球,呈白色粉末状,通过电镜观察其直径在10~20μm,其外观圆整。微球载药量为6.0～11.5μg/mg之间。建立了GR表达抑制C57小鼠模型,各个载AS-ODN可降解微球剂量组GR mRNA在肝、脑、肾上腺中表达均降低。0.1mg载AS-ODN可降解微球剂量组小鼠肝、脑、肾上腺组织中GRmRNA分别下调23%~26%,0.2 mg载AS-ODN可降解微球剂量组小鼠肝、脑、肾上腺组织中GRmRNA分别下调36%~43%,0.4 mg载AS-ODN可降解微球剂量组小鼠肝、脑、肾上腺组织中GRmRNA分别下调26%~41%,0.8 mg载AS-ODN可降解微球剂量组小鼠肝、脑、肾上腺组织中GRmRNA分别下调32%~40%。和空白对照组相比各个载AS-ODN可降解微球剂量组小鼠GRmRNA表达均呈现下调趋势,且和对照组相比下调有统计学意义。和对照组相比,经皮下注射载AS-ODN可降解聚乳酸微球一个月后,小鼠生长发育受到抑制,其体重增长缓慢,并在大体表现上体现出扎堆、竖毛等肾阳虚证外在表现,其中0.2mg剂量组小鼠体重增长最缓慢。采用载AS-ODN及正义寡核苷酸可降解微球对小鼠皮下注射一周后分别观察GRmRNA表达和GR蛋白表达发现,和正义寡核苷酸可降解微球组相比,AS-ODN组小鼠GRmRNA表达和GR蛋白表达均呈现下调趋势。温补肾阳中药作用于GR表达抑制的C57小鼠后, GR在mRNA及蛋白水平的表达有提高作用。在AS-ODN可降解聚乳酸微球皮下注射一周后和对照组相比安慰剂干预组GRmRNA下调39%～41%,补肾干预组下调37%～41%,两者之间无明显差异。在分别经过安慰剂干预一月和补肾中药干预一月后安慰剂干预组GRmRNA下调34%～41%,补肾干预组GRmRNA下调10%～25%,经补肾干预后GRmRNA表达上调。在蛋白表达方面呈现出相似的趋势。在皮下注射载AS-ODN可降解聚乳酸微球一周后,安慰剂组GR蛋白表达下调52%～57%,补肾组GR蛋白表达下调54%～61%,在安慰剂干预一月后GR蛋白下调52%～61%,在补肾干预一月后GR蛋白表达下调16%～32%。在分别经过补肾干预和安慰剂干预一月后补肾组小鼠体重增长快于安慰剂干预组。补肾组抗应激能力也相应强于安慰剂组小鼠。结论:采用皮下注射载反义寡核苷酸可降解乳酸微球能成功的使小鼠中的GR表达降低。温肾壮阳的中药作用于该动物模型后使降低的GR的表达有所上调,采用持续释放反义寡核苷酸的方法能够持续降低GR的表达,并对小鼠的生长发育有抑制作用,采用补肾中药干预能使被抑制的GR表达上调,并能对抗GR表达抑制对小鼠发育抑制作用。从动物大体表现以及用药反证两方面均说明针对GR基因的载反义寡核苷酸可降解微球皮下注射可以作为肾阳虚证造模方法。GR基因表达水平可以作为肾阳虚证的指标之一。