纤维素是地球上分布最广、含量最丰富的可再生性碳源化合物，但它的利用率较低。随着基因工程技术的发展，利用基因工程技术将纤维素酶的基因克隆到细菌、酵母、真菌和植物中以期得到高比活力的重组型纤维素酶。 桑细菌性疫病是危害桑树幼枝、叶的一种主要病害，在我国蚕区普遍发生且危害较严重。通过对病原细菌的分离和测定其细菌学性状后，明确了桑疫病病原细菌是一种丁香假单胞菌，属于荧光假单胞菌属(Pseudomonas syringae)，主要引起桑树幼枝的腐烂和断裂等症。丁香假单孢菌对植物的侵染主要通过细胞壁降解酶系统，在该复合酶中含有一种或多种纤维素酶，对增强病菌的致病力，降解细胞壁起到重要作用。 本试验克隆了桑疫病菌中的纤维素酶基因，并在大肠杆菌中进行表达，以期得到生产高比活力的重组型纤维素酶的工程菌。 根据NCBI中丁香假单孢菌的纤维素酶序列设计特异引物(引入BamH I及EcoR I酶切位点)，采用PCR方法扩增纤维素酶基因，将酶切后的纤维素酶基因片段连接到用相同酶切的pET28a载体上，进行测序分析。结果表明该全长肽基因读码框大小为1173 bp，编码390个氨基酸。通过在NCBI中对氨基酸的比对结果表明，克隆的纤维素酶基因核心序列同源于内切-β-1，4-D-葡聚糖酶。对氨基酸序列的在线分析表明，在N端具有信号肽。 根据该纤维素酶基因的结构特征，构建了全长和成熟肽的pET28a重组载体，分别转化到受体菌大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下进行表达。表达产物经SDS-PAGE电泳后，用Western Blotting和肽指纹图谱方法检测，分别得到分子量为42kD和35kD左右的两条特异表达条带，与全长肽基因和成熟肽基因的表达产物的理论值相符。收集诱导表达的菌体用NaAc-HAc缓冲液洗涤后，经超声波破碎，离心收集上清液，采用DNS法检测不同反应条件下表达产物的酶活力。全长肽(P1/P2)在30-40℃范围内所测的酶活力随着温度的升高而增加，在40℃时达到最高，其后，则逐渐降低。而成熟肽(P3/P4)在30℃所测酶活力为最高。在pH值为7时，成熟肽(P3/P4)纤维素酶的酶活最高。纤维素酶降解纤维素生成的还原糖随着时间的增加而逐渐增加，反应时间在12-15 h时，全长肽的酶活性明显增加，而成熟肽的酶活性则呈下降趋势。同时，其滤纸酶活检测为2.3×10<3>U/L。结果初步表明，重组的大肠杆菌产生的纤维素酶为中性纤维素酶，具有较高的比活力，可以进一步研究成为工程菌。