尽管早在100年前肝素已被一名医学研究生发现,但作为临床抗凝血剂,它的结构至今没有完全被阐明。肝素及硫酸化程度更低的硫酸乙酰肝素是复合单位构成的不同聚合度的非分支多糖混合物。复合单位为C2位可发生磺基化取代的艾杜糖醛酸或葡萄糖醛酸通过1→4糖苷键连接C3位、C6位、N位可以发生磺基化取代或N位可以发生乙酰化取代的葡糖糖胺。肝素在临床不仅用作抗凝剂治疗动脉血栓,静脉血栓,毛细管血栓,在手术过程中防止血液凝固,还对于癌症,老年痴呆症和一些传染病的治疗起着关键作用。肝素经酶β-消除裂解法或化学裂解法获得聚合度更低的低分子量肝素,其给药更可控,副反应更少,半衰期更长。其中市场销售份额最高的低分子量肝素是通过化学β-消除裂解法获得的依诺肝素钠。依诺肝素钠通过含稀有三磺基化葡萄糖胺的残基的五糖序列与抗凝血酶Ⅲ结合,加强其对凝血酶和凝血因子X的抑制完成抗凝血,因此只有能与抗凝血酶Ⅲ结合的组分才具有抗凝血活性。天然肝素中该五糖序列仅占很少一部分,再加上低分子肝素制备工艺中的降解和切割,依诺肝素钠中能与ATⅢ结合的糖链仅占总糖链的30%左右。目前对依诺肝素钠的结构研究主要是通过液相色谱法或液质联用法分析其完整糖链分布、基本组成单元和寡糖片段组成,或使用核磁共振波谱法分析其单糖组成和取代的情况。这些分析都局限于对依诺肝素钠整体的表征,未能对发挥抗凝作用的依诺肝素钠活性糖链进行直接的分析,不利于更好的理解依诺肝素钠抗凝血作用的构效关系。随着软电离技术的发展,多级质谱在低分子肝素的测序中发挥着越来越重要的作用,但由于质谱对非挥发性盐离子不耐受,限制了强阴离子交换色谱(SAX-HPLC)与其在线联用。而我们之前开发的离线SAX-HPLC与电喷雾质谱(ESI-MS-MS)相结合的方法需要多次对样品单一组分进行收集和逐一脱盐,自动化程度低,因此建立辅助测序的数据库十分有必要。为了对依诺肝素钠中抗凝血活性有效成分进行表征,解决离线液质联用测序费时费力的缺点,本研究中我们利用抗凝血酶Ⅲ键合琼脂糖珠亲和色谱在不同盐离子浓度下分离依诺肝素钠中的亲和组分与非亲和组分,通过亲水相互作用色谱与质谱联用(HILIC-ESI-MS)对依诺肝素钠中的亲和组分与非亲和组分进行完整糖链指纹图谱分析和基本组成单元分析。采用分子筛色谱分离低聚合度的亲和组分,对低聚和度的亲和组分进行酶解与亚硝酸降解,获得二糖、四糖及糖醛酸的含量信息,在这些实验数据基础上采用数据库模拟的方式推导出亲和糖链可能的序列及其比例。本研究为深入理解低分子肝素的构效关系提供了新的方法,对于提升药物评价水准、保障药物安全具有应用价值。