合子是高等植物双受精产物之一,也是植物孢子体世代的起点。合子经历细胞分裂,分化等生长发育过程,完成胚胎发生并形成成熟胚,成为种子的重要组成部分。植物胚胎发生是一个十分复杂的自然过程,包含一系列精巧有序的发育事件。合子通常进行一次不等分裂形成一系列形态各不相同的两个子细胞。靠近珠孔端的一个称为基细胞,靠近合点端的一个称为顶细胞；顶细胞体积较小,具浓厚的细胞质及丰富的细胞器；基细胞体积较大,具大的液泡。顶细胞与基细胞在形态与组成上的差异是由合子的极性及不等分裂造成的。顶细胞将发育成成熟胚的胚体,而基细胞则经过有限次数的分裂成为胚柄。因而,顶细胞与基细胞的结构和发育命运呈现出明显不同。顶、基细胞都是合子分裂产物,为什么其各自发育命运迥然不同?两细胞的发育命运是什么时候,又是如何被决定的?顶、基细胞间有无相互作用?这些问题迄今没有明确的答案。本实验室通过激光切割技术结合体外细胞微培养技术,试图追踪顶细胞在没有基细胞存在时的发育情况,主要关注顶细胞发育命运及其与基细胞可能的相互作用,希望对顶细胞发育命运决定的大致时期及其与基细胞、胚柄发育的关系有较明确的认识。主要实验结果如下：1.通过手工显微操作及透明观察烟草合子以后各时期的胚胎,明确了从合子到早期球形胚时期这一过程中细胞的分裂模式,这为我们以后的研究工作提供可以参考的依据。综合以上两种观察方法,我们可以确认在烟草中,作为合子不等分裂产物之一的顶细胞先经历一次垂直于顶基轴向的横分裂,紧接着进行两次相互垂直的纵向分裂,形成早期球形胚。对早期胚胎发生过程中的细胞分裂,发育模式等重要特征进行了细致观察,为离体胚胎发生的观察准备了可资比较的模板。2.在烟草中业已经建立的合子离体培养系统的基础上,我们进一步改进了适合二胞原胚离体培养的条件。发现添加亚精胺能更好地促进细胞分裂及离体胚胎发生。借助该条件对二胞原胚进行离体培养,为在离体条件下研究顶、基细胞的互作和顶细胞命运决定机制提供了较好的技术基础。3.通过已在植物中成功应用的激光显微切割技术,收集大量的顶细胞,并对这些顶细胞进行了多种方法检测,结果显示它们是具备旺盛活力的。依据不同的切割技术,制备了三种类型的顶细胞,并对其进行了离体培养。在三类不同的单独顶细胞的培养中,我们发现带有大量基细胞残留物的顶细胞能持续分裂发育,这为我们后续分析提供宝贵的材料。4.经持续追踪观察及详尽记录所获得的顶细胞的体外培养发育情况,通过对比其与体内及离体正常二胞原胚中顶细胞的分裂发育模式,我们发现独立顶细胞在离体条件下可以分裂形成4-8细胞左右的胚。63.6%的顶细胞体外第一次分裂与体内分裂模式相同,即横向分裂。有26.8%独立顶细胞能进行三次以上分裂形成幼胚。正常二胞原胚离体培养时,顶细胞能进行三次以上分裂并形成幼胚比率为68.5%。这表明单独顶细胞发育命运没有受到基细胞缺失的影响,但其持续的发育在没有基细胞条件下受到抑制。另外,基细胞也影响着独立顶细胞发育产物中邻近基细胞的部分细胞分裂方式。5.以胚胎特异表达的基因Contig824作为标记,经RT-PCR检测,结果证实顶细胞离体培养产物具有胚胎特性。利用早期胚胎特异表达的基因DRP作为标记（NtDRP::GFP）,我们也发现其表达模式在顶细胞离体培养产物中与体内正常胚胎一致。进一步说明顶细胞离体培养产物具备正常胚胎的性质。6.结合顶、基细胞离体发育结果,我们利用光激活绿色荧光蛋白（Photo-activiated green fluorent protein, PAGFP）追踪观察了二胞原胚中顶-基细胞间的物质流动情况,以进一步探索顶基细胞间的相互作用关系。我们构建了ProNtDRP::PAGFP光激活绿色荧光蛋白载体,并获得烟草转基因植株。通过PCR检测及荧光观察证明为阳性植株。摸索了PAGFP的操作条件及其在顶基细胞中的分布情况。通过比较PAGFP的激发光强度,激活模式,激活部位等条件,发现激发光强度在50%,利用点激活模式,对两细胞的核,而不是细胞质激活是比较适合观察到荧光蛋白流动的。7.追踪观察PAGFP在二胞胚中顶基细胞的分布及流向,发现激活基细胞中的GFP后,有15.8%的基细胞内荧光流向顶细胞,而在所有顶细胞实验中没有观察到顶细胞中被激活的GFP荧光流向基细胞。说明类似于GFP这类物质在顶基细胞间的流向是有差别的,即一定物质由顶细胞流入基细胞比由基细胞向顶细胞流入困难。可能正是这种物质的极性运输影响着顶细胞的持续发育。8.利用激光显微切割技术,破坏邻近球形胚体的胚柄细胞,离体培养结果表明胚柄细胞在受到破坏的情况下,胚柄能从破坏的状态恢复过来,并正常生长且最终形成完整的胚柄,说明胚柄细胞有很强的自我修复能力；在此基础上,胚体也继续发育,并未受到部分胚柄细胞暂时破坏的影响,表明胚体的发育依赖于正常生长的胚柄。综上所述,在先前研究的基础上,本文通过体外单细胞微培养技术寻找到更能促进胚胎离体发生的小分子——亚精胺,在此条件下,追踪单独顶细胞的离体发育,结合胚胎特异基因表达检测及特殊的光激活绿色荧光蛋白在细胞间的流动情况观察,结果证明顶细胞的发育命运没有受到基细胞缺失的影响,但其持续的发育在没有基细胞的条件下受到抑制；顶基细胞间物质的极性运输可能就是基细胞影响顶细胞持续发育的因素之一。这些结果为我们理解顶基细胞命运是何时被决定及如何决定,顶基细胞间有无相互作用提供了可靠的实验依据。