第—部分恩度对Lewis肺癌中成熟和未成熟血管的作用差异研究背景及意义新生血管形成是多步骤、多途径的复杂现象,可见于多种生理及病理状态,尤其是恶性肿瘤的发生、发展及转移中起着重要的作用。恶性肿瘤的新生血管形成与生理状态下的区别在于肿瘤中促新生血管生成及抗新生血管生成的因子之间的平衡被打破了。所以与正常组织中大部分新生血管最终成为成熟血管不同,恶性肿瘤中既有成熟的新生血管,也有不成熟的新生血管。而且肿瘤内不同分化程度的血管所占比例的差异与肿瘤的恶性程度有相关性。血管成熟是指在血管形成的后期,血管通过内皮细胞与血管周围细胞间的相互作用完成血管“重塑”的过程,包括部分微血管的退化,微血管周围某些细胞参与血管基底膜的构建,最终内皮细胞逐渐成熟,出现相应的表达分化,并和血管基底膜及各种周围细胞建立良好的相互关系以完善成熟血管的血流动力学特·征及弥散功能。目前研究发现肿瘤内的新生血管生成也存在血管生成后的成熟问题,多项研究证实了肿瘤内的新生血管即有成熟血管,也有未成熟血管,而且肿瘤内的成熟血管在肿瘤的血液供应中起更重要的作用。目前抗肿瘤血管生成药物致肿瘤血管正常化仍是研究的热点,抗血管生成药物致肿瘤血管正常化的观点为提高抗新生血管药物治疗的疗效展示了广阔的前景和探索的方向。但目前有关肿瘤血管正常化的机制及发展过程仍未明确。抗血管生成药物可以导致肿瘤血管正常化,是因为其治疗后肿瘤内的血管数目和结构发生了变化,可以推测其可能对肿瘤内不同分化程度的血管作用存在差异,从而导致肿瘤内血管的形态、功能趋于正常化改变。已有多项研究关注抗血管生成药物治疗后肿瘤微血管的形态学改变及药物弥散功能的变化,但抗血管生成药物对于肿瘤内的成熟血管和未成熟血管的作用差异未见报道。内皮抑素是一种具有很强的抗血管生成作用的药物,内皮抑素的衍生物恩度是我国自主研发的抗肿瘤血管生成的药物,不但解决了批量生产中的蛋白质复性,并获得了更高的生物活性及稳定性。大量的基础及临床前研究证实了其抗肿瘤血管生成作用,同时已有多项临床研究证实了恩度与化疗或放疗联合应用可以使肺癌等多种肿瘤患者获益,并有多项基础研究通过不同的方式证实恩度致肿瘤血管正常化存在。但其对不同成熟程度的肿瘤新生血管的作用差异未见报道。基于上述思路,我们设计了此项研究以观察恩度对成熟和未成熟的肿瘤血管的作用差异。研究目的本研究通过建立鼠Lewis肺癌的皮下移植瘤模型、采用不同的血管标记识别肿瘤内成熟及未成熟微血管(已有多项研究证实CD31阳性而CD34阴性代表未成熟血管,而CD31阳性且CD34阳性代表成熟血管),计算恩度治疗后肿瘤内成熟及未成熟肿瘤微血管的变化来判断恩度对不同成熟度肿瘤新生血管的作用差异,并通过双光子显微镜直观的观察恩度治疗后Lewis肺癌模型中肿瘤微血管结构形态的变化。研究方法建立40只小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型,待移植瘤生长至长径约6-7mm时,随机分为4组,次日起分别经腹腔注射生理盐水钠(normal saline, NS)、低剂量恩度(5mg/kg)、中剂量恩度(25mg/kg)或高剂量恩度(50mg/kg),每天给药1次,连续给药14天。用药后每天观察两组小鼠的一般情况,并每隔一天测定小鼠肿瘤的大小。药物治疗7天后,实验小鼠尾静脉注射荧光素标记的葡聚糖(FD2000S),并于当日使用双光子显微镜观察肿瘤血管形态改变。药物治疗14天后,处死小鼠,并完整切除肿瘤,免疫组织化学检测肿瘤CD31及CD34的表达情况,并分别计数CD31及CD34标记的肿瘤血管的微血管密度(MVD)。研究结果1.药物治疗开始后,隔日测定并计算各组小鼠皮下移植肿瘤的平均体积,获得各组肿瘤生长曲线,观察到药物治疗14天后,各剂量恩度治疗组体积均明显小于对照组,尤其是高剂量恩度治疗组更加明显(低、中、高剂量恩度治疗组肿瘤体积分别为3991.51 ± 761.87mm3,2735.06±558.30mm3和1433.86±275.27mmm3,而对照组为4869.80±989.95mm3,P<0.05)。高剂量恩度治疗组的肿瘤体积也明显小与低、中剂量恩度治疗组(P<0.05)。2.药物治疗7天后,双光子显微镜观察发现与小鼠正常下肢肌肉血管比较,与对照组的血管紊乱无章不同,不同剂量恩度治疗后Lewis肺癌移植瘤显微镜下观察微血管形态更加接近于正常下肢肌肉的微血管,也即：恩度治疗后导致的肿瘤血管正常化表现；并随着恩度剂量的提高,微血管的数目依次减少。3.不同标记免疫组化染色发现：CD31免疫组化染色标记的血管明显比CD34免疫组化染色标记的血管增多提示CD31标记血管与CD34所标记血管的显著不同。4、与对照组相比,不同剂量恩度治疗14天后CD31MVD均明显减少,尤其是在高剂量恩度治疗组(低、中、高剂量恩度治疗组CD31MVD分别为61.56±6.53、52.80±5.77和39.22±6.94,与对照组68.98±7.62相比,P<0.05)。然而,与对照组相比,不同剂量恩度治疗14天后CD34MVD并未见明显减少(低、中、高剂量恩度治疗组CD34MVD分别为28.02±3.15、26.52±2.54和24.68±4.13与对照组27.54±2.98相比,P>0.05)。5、CD31+ CD34或CD31 MVD减去CD34 MVD代表未成熟的血管,而CD34+代表成熟血管。与对照组相比,不同剂量恩度治疗后,CD31 MVD减去CD34 MVD值明显下降,并且随着恩度剂量的增加,这种下降更不明显。(低、中、高剂量恩度治疗组CD31MVD-CD34MVD分别为3.54±5.97,26.28±5.33和14.54±3.61与对照组41.44±6.62相比,P<0.01)；而CD34无明显变化,提示不同剂量的恩度主要抑制了未成熟血管,而对成熟血管无显著抑制作用。研究结论1、不同剂量的恩度对Lewis肺癌移植瘤有抑制作用,而且随着药物剂量的提高,这种抑制作用逐步增强。2、CD31免疫标记及CD34免疫标记所标记的Lewis肺癌移植瘤中的微血管有很大的不同,可以据此判断肿瘤内存在的成熟血管及未成熟血管。3、不同剂量恩度治疗第7天,有肿瘤血管形态趋于正常血管的变化趋势。4、不同剂量的恩度作用14天后,主要表现为肿瘤CD31标记的微血管密度的下降,而CD34标记的成熟血管的微血管密度变化不明显,进一步分析可得出结论恩度主要抑制了肿瘤内的未成熟血管,而对成熟血管无明显抑制作用。第二部分超声造影评价恩度治疗后Lewis肺癌血流动力学动态变化的研究研究背景及意义抗肿瘤血管生成治疗是目前治疗肿瘤的研究热点和重点。抗新生血管生成药物的作用已经逐渐发展为包括抑制肿瘤血管生成、致肿瘤血管正常化、改善肿瘤微环境等涉及各个方面的多方探索。由于抗肿瘤血管生成药物作用于肿瘤内异常的新生血管,其治疗首先导致肿瘤新生血管的变化,继而会引起肿瘤内血容量、血流灌注速度及其它血流动力学指标的改变,因为这种新生血管的改变和肿瘤血流动力学的变化早期不一定伴随有肿瘤的缩小,所以采用观察肿瘤体积变化的方法来判断抗肿瘤新生血管治疗的疗效显然不能早期预测疗效甚至是不科学的。所以监测抗肿瘤新生血管治疗后肿瘤微血管的改变或者某些血流动力学指标的改变成为临床上评价抗血管生成治疗的有效指标。肿瘤内新生血管数量及结构异常、毛细血管通透性改变等导致肿瘤组织内血容量、血液灌注等血流动力学异常是肿瘤影像学检查异常增强的理论基础,而新生血管生成治疗后肿瘤血管的正常化也就可以表现为其原有异常强化形式的改变,所以目前很多影像学手段被探索用于抗肿瘤新生血管生成治疗后的疗效评估,这些手段主要包括：CT、MRI、核医学技术及超声造影。而其中超声技术因其易于进行、可携带、低耗费、超安全,卓越的空间分辨率和实时影像能力在临床获得最广泛应用,超声造影技术最早应用于良恶性肿瘤的鉴别,在乳腺、肝脏等某些器官有独特的影像技术优势。近年来多项临床前及临床研究探索其作为判断抗血管生成药物治疗肿瘤后的早期疗效评估,取得了大量有意义的结果,但大多集中在与微血管密度相关的无创性显示肿瘤微血管数目减少及肿瘤血流灌注下降的方面,关于抗血管生成药物治疗早期阶段的肿瘤血管正常化时间窗内的肿瘤血液灌注及血流动力学动态改变报道极少,而这对于判断抗血管生成药物治疗与放化疗联合应用的最佳时间剂量模式至关重要。恩度作为一种重要的抗血管生成药物,其抑制肿瘤血管及致肿瘤血管正常化已被多项临床前及临床研究证实,但尚没有研究探索恩度治疗后肿瘤微血管的血流动力学动态变化。研究目的：本研究采用Lewis肺癌移植瘤小鼠模型进行腹腔内注射恩度治疗或生理盐水对照治疗,每隔2天行超声造影检查动态观察两组肿瘤各血流灌注参数：峰值强度、达峰时间及平均通过时间的变化,观察恩度治疗后肿瘤内血流动力学的动态改变特定,并于治疗结束后,行免疫组化CD31的微血管密度计数,并将超声造影参数与肿瘤的微血管密度进行相关性比较,旨在探讨恩度治疗后各超声造影参数的动态变化来推断恩度导致的肿瘤微血管结构或功能变化。研究方法建立12只小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型,待移植瘤生长至长径约6-7mm时,随机分为2组,次日起分别经腹腔注射生理盐水钠(normal saline,NS)或恩度(5mg/kg),每天给药1次,连续给药14天。用药后每天观察两组小鼠的一般情况,并每隔一天测定小鼠肿瘤的大小。药物治疗后,分别于第2、5、8、11、14对各动物模型移植瘤行超声造影检查,并应用超声造影定量分析软件进行脱机分析,获取峰值强度(PI)、达峰时间(TTP)和平均通过时间(mTT)等血流动力学参数。药物治疗14天行超声造影检查后,处死小鼠,并完整切除肿瘤,免疫组织化学检测肿瘤CD31并计数微血管密度(MVD),比较各超声造影参数与微血管密度之间的相关性。研究结果1、成功建立移植瘤,动态观察各组移植瘤大小并记录,药物治疗结束时,对照组及恩度治疗组小鼠移植瘤体积分别为：生理盐水组：5098.88±498.17mmm3,低剂量恩度治疗组：4374.21±242.05 mm3,P<0.05。2、分别在药物治疗治疗后2、5、8、11和14天行超声造影检查,记录每次测量相关血流动力学参数,随着治疗时间的延长,恩度组的峰值强度逐渐低于对照组,于第11天时与对照组开始有显著性差异(25.89±10.27dB vs 35.17±12.33 d. P<0.05):恩度组治疗后各时间点的达峰时间均较对照组略延长,至第8天时与对照组相比差异有显著性(10.54±5.36 vs 6.54±4.23 at day 8,P<0.05),第14天时达峰时间差异不显著。而恩度组与对照组相比,其平均通过时间略有缩短,从第5天即开始有统计学差异(59.35±11.22 vs 82.25±11.36 at day 5,P<0.05),至第11天以后又不再有差异。3、实验结束后,对照组免疫组织化学检测的微血管密度为72.93±12.20,恩度治疗组的微血管密分别为54.07±10.76。与对照组相比,恩度治疗组的微血管密度显著减少,恩度治疗组与对照组相比差异具有统计学差异(P＜0.05)4、对超声造影定量及拟合曲线分析(团注法)测定的肿瘤灌注参数与反映肿瘤血管生成的微血管密度进行相关性分析显示：峰值强度(PI)与微血管密度呈正相关(r=0.682,P＜0.05),而其它参数：达峰时间(TTP)、平均通过时间(mTT)与微血管密度之间无明显相关性(P>0.05)。研究结论1、超声造影可以用于评价恩度治疗后Lewis肺癌移植瘤血流动力学动态变化,其指标的变化可以从一些方面反映肿瘤微血管结构及功能的变化。2、在恩度治疗过程中,不同的超声造影血流动力学参数表现为不同的变化规律,这些不同的参数代表肿瘤微血管结构或功能对血流灌注的影响。3、峰值强度主要与肿瘤内微血管密度相关,而平均通过时间及达峰时间与微血管密度不相关,结合这不同参数的变化规律,提示恩度在致肿瘤微血管密度明显下降以前就有肿瘤内血管结构及功能的趋于正常改变,从而导致了某些血流动力学参数的变化,即所谓的肿瘤血管正常化。